Annexin V-FITC/PI Apoptosis Kit

Ⅰ. Zellfärbung in Suspension
ⅰ.Färbung von Suspensionszellen

Zentrifugieren die Zellen bei 1000g für 5 Minuten, verwerfen das Überstand und resuspendieren die Zellen vorsichtig in einer geeigneten Menge PBS. Zählen die Zellen.
Hinweis: Die Resuspendierung der Zellen in der PBS dient auch dazu, die Zellen zu reinigen, um sicherzustellen, dass die nachfolgende Bindung von Annexin V-FITC nicht beeinträchtigt wird. Dieser Schritt darf nicht ausgelassen werden.
Nehmen etwa 5-10×10⁴ Zellen, zentrifugieren sie bei 1000g für 5 Minuten, verwerfen das Überstand und fügen Sie 195 μl Annexin V Bingdungspuffer hinein, um die Zellen vorsichtig zu resuspendieren.
Fügen 5 μl Annexin V-FITC und 10 μl Propidiumiodid (PI)-Färbelösung hinein und mischen vorsichtig.
Inkubieren die Zellen 10-20 Minuten bei Raumtemperatur (20-25℃) im Dunkeln.
Hinweis: Während der Inkubation können die Zellen 2-3 Mal resuspendiert werden, um die Färbung zu verbessern.
Überführen die Probe in ein Eisbad. Es wird empfohlen, sie mit Aluminiunfolle vor Licht zu schützen.
Die Färbeergebnisse mit Durchflusszytometrie oder Fluoreszenzmikroskopie analysieren.
ⅱ. Nach Verdauung von Adhärenten Zellen
1. (Wichtiger Schritt) Aspiriere das Zellkulturmedium und überführe es in ein passendes Zentrifugenröhrchen.
2. (Schlüsselschritt) Waschen die adhärent wachsenden Zellen vorsichtig einmal mit PBS, fügen eine passende Menge Trypsin-Verdauungslösung hinzu und inkubieren die Zellen bei Raumtemperatur, bis sie rund und locker werden. Sobald sich die Zellen bei leichtem Schütteln ablösen, fügen Sie sofort das in Schritt 1 gesammelte Zellkulturmedium hinzu, um die Bewältigung zu stoppen. Pipettieren die Zellen vorsichtig ab.
Hinweise:
Um apoptische oder nekrotische Zellen einzusammeln, die im Kulturmedium suspendiert sind, sollte das Zellkulturmedium aus Schritt 1 zur Beendigung der Verdauung angewendet werden. Die Trypsin-Verdauung muss genau abgestimmt sein: Eine zu kurze Verdauung erfordert starkes Pipettieren, was Zellmembranschäden hervorrufen und zu falsch-positiven Nekrose-Ergebnissen führen kann.
Eine zu lange Verdauung kann ebenfalls Zellmembranschäden verurschen und die Bingdung von Phosphatidylserin (PS) an Annexin V-FITC stören, was die Apoptose-Analyse beeinträchtigt.
Vermeiden EDTA in der Trypsinlösung, da Annexin V ein Ca^2＋.abhängiges Protein ist. EDTA chelatiert Ca^2＋ und kann die Bingdung von Annexin V an PS stören.
Falls Trypsin mit EDTA verwendet wurde, sollten die Zellen mehrfach mit PBS gewaschen werden, bevor Annexin V-FITC hinzugefügt wird. Überführen Sie die Zelllösung in ein Zentrifugenröhrchen, zentrifugieren Sie bei 1000g für 5 Minuten, verwerfen Sie das Überstand, resuspendieren Sie die Zellen vorsichtig in PBS und zähöen Sie sie.
Hinweis: Entfernen Sie Trypsin so weit wie möglich, da verbleibendes Trypsin Annexin V-FITC abbauen und die Färbung beeinträchtigen kann.
Nehmenetwas 5-10×10⁴ Zellen, zentrifugieren Sie sie bei 1000g für 5 Minuten, verwerfen das Überstand und fügen 195 μl Annexin V Bingdungspuffer hinzu. Resuspendieren die Zellen vosichtig.
Fügen 5 μl Annexin V-FITC und 10 μl Propidiumiodid V-FITC und 10 μl Propidiumiodid-Färbelösung hinzu, mischen Sie vorsichtig und inkubieren Sie die Zellen 10-20 Minuten bei Raumtemperatur (20-25℃) im Dunkeln.
Hinweis: Während der Inkubation können die Zellen 2-3 Mal resuspendiert werden, un die Färbung zu verbessern.
Überführen die Probe in ein Eisbad und schützen Sie sie mit Aluminiumfolle vor Licht. Die Färbeergebnisse mit Durchflusszytometrie oder Fluoreszenzmikroskopie analysieren.
Ⅱ. In-situ-Fluoreszenzdetektion von Adhärenten Zellen (Optional) Falls möglich, zentrifugieren die Multiwell-Platte bei 1000g für 5 Minuten nach der Apoptose-Induktion. Entfernen das Zellkulturmedium, waschen Sie mit PBS und entfernen Sie es wieder. Falls möglich, zentrifugieren die Multiwell-Platte erneut bei 1000g für 5 Minuten.
Fügen 195 μl Annexin V Bindungspuffer hinzu.
Fügen 5 μl Annexin V-FITC und 10 μl Propidiumiodid-Färbelösung hinzu, mischen Sie vorsichtig und inkubieren die Zellen 10-20 Minuten bei Raumtemperatur (20-25℃) im Dunkeln.
Überführen die Probe in ein Eisbad und schützen Sie sie mit Aluminiumfolie vor Licht.
Analysieren die Färbeergebnisse mit einem Fluoreszenzmikroskop.
Vorsichtsmaßnahmen
Untersuchen die Zellen möglichst sofort nach der Färbung, ideaöerweise innerhalb 1 Stunde. EIne längere Lagerung in Annexin V Bingdungspuffer wird nicht empfohlen.
Annexin V-FITC fluoesziert grün (Ex/Em: 525/530 nm, auch mit 488 nm anregbar); Propidumiodid (PI) fluoresziert rot (Ex/Em: 535/617 nm nach Bindung an Nkleinsäuren).
Falls die Analyse verzögert wird, sollten die Zellen zentrifugiert und in PBS oder Annexin V Bindungspuffer resuspendiert werden.
Falls eine Fluoreszenzmikroskopie nach der Suspensionsfärbung durchgeführt wird, sollten die Zellen in 50-100 μL Bindungspuffer resuspendiert und auf einen Objektträger aufgetragen werden.
Beim ersten Durchflusszytometer-Test sollten drei Kontrollgruppen (ungefärbt, PI-gefärbt, Annexin V-FITC-gefärbt) eingerichtet werden.
Falls zu viele falsch-positive PI-Zellen auftreten, kann Annexin V-FITC 3-10-fach mit PBS verdünnt werden.
Falls zu viele falsch-positive PI-Zellen auftreten, kann Annexin V-FITC 3-10-fach mit PBS verdünnt werden.
Das Produkt eignet sich nur für zelluläre Apoptose-Assays, nicht für Gewebeproben.
Nervenzellen neigen zu Membranschäden und falsch-positiven Ergebnissen-das Produkt ist nicht für Apoptose-Tests an Nervenzellen geeignet. Tests an Nervenzellen geeignet.
Fluoreszenzfarbstoffe bleichen aus - schützen die Proben vor Licht.
Tragen Sie einen Laborkittel und Handschuhe für Ihre Sicherheit.