3X FLAG Peptide (Synonyms: H-Met-Asp-Tyr-Lys-Asp-His-Asp-Gly-Asp-Tyr-Lys-Asp-His-Asp-Ile-Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-OH)

Protocole pour l'expression et la purification des protéines avec le peptide 3×FLAG [1] :

1. Les plasmides contenant les gènes étiquetés FLAG ont été transfectés dans des cellules 293T pendant 2 jours.

2. Les cellules ont été récoltées par centrifugation à 14 000 rpm pendant 10 min à 4℃, puis lysées avec un tampon HEPES (150 mM de chlorure de sodium, 50 mM de HEPES, pH 7,4, 5 mM d'EDTA, 1 % (p/v) de désoxycholate de sodium, 1 % (v/v) de Triton X-100, 0,2 % de fluorure de sodium, 0,1 % d'orthovanadate de sodium et un cocktail d'inhibiteurs de protéase).

3. Des billes de gel Anti-FLAG M2 ont été ajoutées et incubées sur un agitateur rotatif à 4℃ pendant 2 heures. Les billes de gel M2 ont été récoltées par centrifugation à 3 000 rpm pendant 1 min et lavées quatre fois dans un tampon HEPES.

4. Les protéines étiquetées FLAG ont été purifiées par compétition avec le peptide 3×FLAG. Les billes M2 ont été resuspendues avec un tampon contenant 1,5 mg/mL de peptide 3×FLAG et incubées à 4℃ pendant 2 heures.

5. Après centrifugation à 5 000 rpm pendant 1 min, le surnageant a été purifié par filtration sur gel en utilisant une colonne SuperdexTM 200 augmentée, équilibrée dans un tampon de stockage (50 mM Tris-HCl, 37 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5 mM DTT).

6. Toutes les protéines purifiées ont été concentrées par filtration centrifuge et stockées en aliquotes à -80℃.

7. La protéine purifiée a été quantifiée à l'aide d'un spectrophotomètre ND-2000 NanoDrop avec une OD de 280 nm et vérifiée par coloration au bleu de Coomassie.

Ce protocole fournit uniquement une ligne directrice et doit être modifié en fonction de vos besoins spécifiques.

Protocole pour les analyses Co-IP et Co-IP-MS utilisant le peptide 3×FLAG [2] :

1. Les lysats cellulaires ont été centrifugés à 13 300 rpm pendant 15 min à 4℃ pour éliminer les cellules intactes.

2. Le surnageant a été incubé soit avec de l'immunoglobuline G (IgG) de contrôle, soit avec un anticorps primaire toute la nuit dans un tampon IP (150 mM de NaCl, 20 mM HEPES à pH 7,4, 1 % Triton X-100, 12,5 mM β-glycérophosphate, 1,5 mM MgCl2, 2 mM EGTA avec des inhibiteurs de phosphatase et de protéase), suivi d'une incubation avec 20 μl de billes de protéine A/G resuspendues pendant 2 heures à 4℃ pour extraire les protéines liées.

3. Pour l'IP séquentiel, la protéine liée a été élue des billes par incubation avec 5 volumes de gel compact de solution d'élution de peptide 3×FLAG (concentration finale de 150 ng/mL) à 4℃ pendant 2 heures, puis immunoprécipitée avec un second anticorps toute la nuit à 4℃.

4. Les billes ont été centrifugées à 1 000g pendant 5 minutes à 4℃ pour éliminer le surnageant, lavées 4 fois avec le tampon IP, puis bouillies pendant 20 min à 95℃. Les échantillons ont été analysés sur un gel SDS-PAGE, suivi d'une coloration au bleu brillant de Coomassie R-250.

5. Les bandes de gel ont ensuite été excisées, décolorées, trypsinisées et soumises à une analyse MS pour identifier les protéines individuelles à l'aide de la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS).

Ce protocole fournit uniquement une ligne directrice et doit être modifié en fonction de vos besoins spécifiques.

Références :

[1]. Gao XK, Rao XS, et al. Phase separation of insulin receptor substrate 1 drives the formation of insulin/IGF-1 signalosomes. Cell Discov. 2022 Jun 28;8(1):60. doi: 10.1038/s41421-022-00426-x. PMID: 35764611; PMCID: PMC9240053.

[2]. Cong M, Wang Y, et al. MTSS1 suppresses mammary tumor-initiating cells by enhancing RBCK1-mediated p65 ubiquitination. Nat Cancer. 2020 Feb;1(2):222-234. doi: 10.1038/s43018-019-0021-y. Epub 2020 Jan 20. PMID: 35122005.