Annexin V-FITC/PI Apoptosis Kit

Ce plan est uniquement un guide, veuillez l’adapter en fonction de vos besoins spécifiques.

I. Coloration de la suspension cellulaire :

i. Coloration des cellules en suspension

1. Centrifugez les cellules à 1000 g pendant 5 minutes, éliminez le surnageant, puis resuspendez doucement les cellules dans une quantité appropriée de PBS et comptez-les.

Remarque : La resuspension des cellules dans le PBS joue également un rôle de lavage pour garantir que la liaison ultérieure de l'Annexine V-FITC ne soit pas perturbée. Cette étape ne peut pas être omise.

2. Prenez environ 5-10 × 10^4 cellules, centrifugez à 1000 g pendant 5 minutes, éliminez le surnageant, et ajoutez 195 μl de Tampon de Liaison Annexine V pour resuspendre doucement les cellules.

3. Ajoutez 5 μl d’Annexine V-FITC et 10 μl de solution de coloration au Propidium Iodide, puis mélangez doucement.

4. Incubez à température ambiante (20-25℃) à l’abri de la lumière pendant 10-20 minutes.

Remarque : Les cellules peuvent être resuspendues 2 à 3 fois pendant l'incubation pour améliorer les résultats de la coloration.

5. Transférez l'échantillon dans un bain de glace. Il est recommandé d'utiliser du papier aluminium pour le protéger de la lumière.

6. Utilisez la cytométrie en flux ou la microscopie à fluorescence pour détecter les résultats de la coloration.

ii. Pour la détection post-digestion des cellules adhérentes :

1. (Étape importante) Aspirez le milieu de culture cellulaire et transférez-le dans un tube à centrifuger de taille appropriée.

2. (Étape clé) Utilisez du PBS pour laver doucement les cellules adhérentes cultivées une fois, ajoutez une quantité appropriée de solution de digestion des cellules (trypsine) pour digérer les cellules, et incubez à température ambiante jusqu'à ce que les cellules deviennent progressivement rondes et lâches, et que les cellules apparaissent lors du secouage doux. Après qu'elles se détachent, ajoutez immédiatement le milieu de culture cellulaire collecté à l'étape 1 aux cellules digérées pour arrêter la digestion, puis pipetez doucement les cellules.

Remarques :

① Pour recueillir les cellules apoptotiques ou nécrotiques suspendues dans le milieu de culture, il est recommandé d'utiliser le milieu de culture cellulaire collecté à l'étape 1 pour arrêter la digestion à cette étape.

② La digestion à la trypsine doit être appropriée. Si le temps de digestion est trop court, les cellules doivent être soufflées fortement pour se détacher, ce qui risque d’endommager la membrane cellulaire, entraînant des faux positifs de nécrose cellulaire. Si le temps de digestion est trop long, cela peut également endommager la membrane cellulaire et affecter la liaison de la phosphatidylsérine sur la membrane cellulaire avec l'Annexine V-FITC, interférant ainsi avec la détection de l'apoptose cellulaire.

③ Évitez autant que possible l'EDTA dans la solution de digestion à la trypsine. L'Annexine V est une protéine dépendante du Ca2+. L'EDTA peut chélater le Ca2+, perturbant ainsi la liaison de l'Annexine V avec la phosphatidylsérine (PS) et affectant les résultats expérimentaux.

④ Si vous utilisez de la trypsine contenant de l'EDTA pour digérer les cellules, il est recommandé de laver les cellules plusieurs fois avec du PBS après digestion et avant d'ajouter l'Annexine V-FITC pour éliminer l'effet de l'EDTA sur la détection de l'apoptose.

3. Transférez la solution cellulaire dans un tube à centrifuger, centrifugez à 1000 g pendant 5 minutes, éliminez le surnageant, recueillez les cellules, puis resuspendre doucement les cellules dans du PBS et comptez-les.

Remarque : Essayez d’éliminer autant que possible la trypsine à cette étape. La trypsine restante digérera et dégradera l'Annexine V-FITC ajoutée ultérieurement, affectant ainsi l’effet de coloration.

4. Prenez environ 5-10 × 10^4 cellules, centrifugez à 1000 g pendant 5 minutes, éliminez le surnageant, ajoutez 195 μl de Tampon de Liaison Annexine V et resuspendre doucement les cellules.

5. Ajoutez 5 μl d’Annexine V-FITC et 10 μl de solution de coloration au Propidium Iodide, mélangez doucement, et incubez à température ambiante (20-25℃) dans l’obscurité pendant 10-20 minutes.

Remarque : Les cellules peuvent être resuspendues 2 à 3 fois pendant l'incubation pour améliorer les résultats de la coloration.

6. Transférez l'échantillon dans un bain de glace. Il est recommandé d'utiliser du papier aluminium pour le protéger de la lumière.

7. Utilisez la cytométrie en flux ou la microscopie à fluorescence pour détecter les résultats de la coloration.

II. Détection de fluorescence in situ des cellules adhérentes :

1. (Optionnel) Si les conditions le permettent, il est recommandé de centrifuger la plaque multi-puits à 1000 g pendant 5 minutes après l'induction de l'apoptose.

2. Aspirez le milieu de culture cellulaire, ajoutez du PBS et lavez une fois. Si les conditions le permettent, il est recommandé de centrifuger la plaque multi-puits à 1000 g pendant 5 minutes avant d’aspirer et de jeter le PBS.

3. Ajoutez 195 μl de Tampon de Liaison Annexine V.

4. Ajoutez 5 μl d’Annexine V-FITC et 10 μl de solution de coloration au Propidium Iodide, mélangez doucement, et incubez à température ambiante (20-25°C) à l’abri de la lumière pendant 10-20 minutes.

5. Transférez l'échantillon dans un bain de glace. Il est recommandé d'utiliser du papier aluminium pour le protéger de la lumière.

6. Utilisez un microscope à fluorescence pour détecter les résultats de la coloration.

Précautions :

1. Les cellules doivent être testées dès que possible après la coloration. Il est recommandé de terminer le test dans l'heure. Il n'est pas conseillé de conserver les cellules trop longtemps dans le Tampon de Liaison Annexine V.

2. Si la détection est réalisée par cytométrie en flux, elle peut être effectuée immédiatement. L'Annexine V-FITC est une fluorescence verte, avec une longueur d'onde d'excitation/émission maximale de 525/530 nm, et peut également être excitée avec des canaux à 488 nm ; le Propidium Iodide (PI) est une fluorescence rouge, et sa longueur d'onde d'excitation/émission maximale après liaison à l'acide nucléique est de 535/617 nm.

3. Après la coloration, vous pouvez tester les cellules directement sans changer la solution de coloration. Si vous ne pouvez pas tester immédiatement, il est recommandé de centrifuger pour éliminer la solution de coloration et de resuspendre les cellules dans du PBS ou du Tampon de Liaison Annexine V.

4. Si les cellules sont détectées au microscope à fluorescence après la coloration en suspension, il est recommandé de recueillir les cellules par centrifugation à 1000 g pendant 5 minutes, de resuspendre doucement les cellules dans 50-100 μl de Tampon de Liaison Annexine V, et d’observer au microscope à fluorescence après étalement.

5. Lors de la première utilisation du cytomètre en flux pour la détection, il est recommandé de configurer trois groupes témoins : non coloré, coloré uniquement avec PI et coloré uniquement avec Annexine V-FITC.

6. Lorsque vous utilisez la cytométrie en flux pour la détection, si trop de cellules faussement positives pour PI sont détectées lors de la coloration avec l'Annexine V-FITC seule, et que cela ne peut pas être amélioré en ajustant les paramètres, vous pouvez diluer l'Annexine V-FITC de 3 à 10 fois avec du PBS avant la détection.

7. Ce produit est uniquement adapté à la double coloration de l'apoptose dans les modèles cellulaires. Il convient également à la détection de l'apoptose des spermatozoïdes, mais ne peut pas être utilisé pour détecter l'apoptose dans des échantillons de tissus.

8. L'Annexine V-FITC marque les cellules apoptotiques en se liant à la phosphatidylsérine (PS). La PS est relativement conservée parmi différentes espèces. Par conséquent, ce produit est adapté à la détection de l'apoptose dans des cellules de différentes espèces. Pour les étapes expérimentales correspondantes, veuillez vous référer à la littérature pertinente.

9. Ce produit peut être utilisé pour colorer les cellules en combinaison avec des anticorps, mais il est recommandé de les colorer séparément. Il est conseillé de remplacer le tampon par le Tampon de Liaison Annexine V pour la détection de l'apoptose après la coloration avec des anticorps.

10. Si l'échantillon provient du sang, les plaquettes doivent être éliminées. La PS présente dans les plaquettes interférera avec les résultats expérimentaux.

11. La membrane des cellules nerveuses est facilement endommagée et éversée, ce qui entraîne des faux positifs. Par conséquent, ce produit n'est pas adapté à la détection de l'apoptose des cellules nerveuses.

12. Soyez doux lors de la manipulation, et vérifiez s'il y a des cellules au fond du tube après centrifugation.

13. Les colorants fluorescents sont sujets aux problèmes d'extinction. Veuillez éviter autant que possible l'exposition à la lumière pendant l'expérience pour ralentir l'extinction de la fluorescence.

14. Pour votre sécurité et votre santé, veuillez porter une blouse de laboratoire et des gants jetables.