One-step TUNEL Apoptosis Detection Kit (Green, FITC)

I Réactifs fournis par l’utilisateur

1.Echantillons cellulaires et coupes congelées :

Paraformaldéhyde à 4% fraîchement préparé (dans PBS), Triton X-100 à 0,2% (dans PBS).

Ces réactifs peuvent être préparés 1-2 jours avant votre opération et stockés à 4°C.

2.Coupes en paraffine

Xylène, éthanol anhydre

3.Autre réactifs:

PBS, ddH2O, milieu de montage Antifade avec DAPI (Cat.No. GC26283)

II Protocole expérimental

1.1 Prétraitement de lames cellulaires

1.1.1 Dans une plaque de puits de taille appropriée, cultiver les cellules adhérentes sur les lamelles de cellules traitées par TC. Après induction de l’apoptose, rincer les lamelles deux fois avec PBS.

1.1.2 Ajouter un excès de paraformaldéhyde à 4% pour immerger complètement les lamelles et placer à 4°C pendant 25 minutes pour fixer les cellules.

1.1.3 Laver 2-3 fois avec une solution de PBS pendant 5 minutes à chaque fois à température ambiante.

1.1.4 Ajouter un excès de Triton X-100 à 0,2% et perméabiliser à température de chambre pendant 5 minutes.

Remarque : Triton X-100 est préféré pour la perméabilisation. La protéinase K peut également être utilisée pour la perméabilisation. Diluer la solution de protéinase K à 2mg/mL avec PBS dans un rapport de 1:100 pour obtenir une concentration finale de 20µg/mL. Ajouter 100µL de solution de protéinase K diluée à chaque échantillon, de sorte que la solution recouvre toute la surface de l’échantillon, et incuber à température ambiante pendant 5 minutes (la durée d’incubation doit être ajustée en fonction des besoins d’exploration). La durée maximale de perméabilisation ne doit pas dépasser 15 minutes.

1.1.5 Laver 2-3 fois avec une solution de PBS pendant 5 minutes à chaque fois.

1.2 (Etapes facultative). Témoin positif.

1.2.1 Préparer une cassette humide en versant une couche d’eau au fond et en posant une pellicule plastique propre platement au-dessus de l’eau.

1.2.2 Diluez le tampon DNase I 10× en utilisant de l’eau distillée déionisée (ddH2O) dans un rapport de 1:100 pour une utilisation ultérieure.

1.2.3 Ajoutez 100µl de tampon DNase I 1× sur la pellicule plastique dans la cassette humide. Retirez les lamelles de la plaque et placez-les côté cellules vers le bas pour recouvrir le tampon DNase I 1×. Equilibrer à température ambiante pendant 5 minutes.

1.2.4 Diluez DNase I (2000U/mL) avec tampon DNase I 1× pour obtenir une concentration finale de 20U/mL.

1.2.5 Ajoutez 50µL de solution de DNase I à 20U/mL sur la pellicule plastique dans la cassette humide.

1.2.6 Sortez les lamelles, absorbez délicatement l’excès de liquide et placez-les côté cellules vers le bas sur la solution DNase I à 20U/mL. Incubez à 37°C pendant 10 minutes.

1.2.7 Sortez les lamelles, placez-les dans une plaque de puits propre avec le côté cellules vers le haut, et lavez-les avec un excès de PBS 3 fois, 5 minutes à chaque fois.

Remarque : Un pot ou une plaque de puits de coloration séparé doit être utilisé pour le témoin positif. ADNase I résiduelle sur le témoin positif peut provoquer des signaux faux positifs dans le groupe expérimental.

1.3 Marquage de détection

1.3.1 Préparez une cassette humide protégée de la lumière, versez une couche d’eau au fond et posez une pellicule plastique propre platement au-dessus de l’eau.

1.3.2 Diluez le tampon d’Equilibrage 5× en tampon d’Equilibrage 1× en utilisant de l’eau distillée déionisée (ddH₂O) dans un rapport de 1:5.

1.3.3 Ajoutez 100µL de tampon d’Equilibrage 1× sur la pellicule plastique dans la cassette humide, sortez les lamelles vers le bas, et équilibrez à température ambiante pendant 5-10 minutes.

1.3.4 Pendant l’équilibrage, préparez la solution de marquage TdT selon le tableau ci-dessous dans un bain de glace et dans les conditions protégées de la lumière.

1.3.5 Après l’équilibrage, ajoutez 50µL de solution de marquage sur une pellicule plastique propre. Sortez les lamelles, absorbez délicatement l’excès de liquide, et placez-les côté cellule vers le bas sur la solution de marquage correspondante, en veillant à éviter la lumière.

Remarque : Volume de la solution de marquage : Pour les réactions couvrant une surface inférieure à 5cm², utilisez 50µL par réaction. Déterminez le volume total de la solution de marquage TdT nécessaire en multipliant 50µL par le nombre de réactions de groupe expérimental et de témoin positif. Pour des surfaces beaucoupe plus grandes, le volume de réactif peut être augmenté proportionnellement.

1.3.6 Fermez hermétiquement le couvercle de la cassette humide, évitez la lumière, empêchez les lamelles de recouvrement de sécher et incubez à 37°C pendant 60 minutes.

1.3.7 Sortez les lamelles de recouvrement, retirez délicatement l’excédent de liquide et lavez 2 fois avec PBS fraîche pendant 5 minutes à température ambiante.

Remarque : Si le bruit de fond est trop élevé, afin de réduire le bruit de fond, après le lavage avec PBS, l’échantillon peut être lavé 3 fois avec PBS contenant 0,1% de Triton X-100 et 5mg/mL de BSA pendant 5 minutes, afin que les marqueurs libres non-réagis puissent être retirés.

1.3.8 Ajoutez une goutte de Milieu de Montage Antidégradation avec DAPI  (Cat. No. GC26283) sur la lame.

1.3.9 Retirez la lamelle de recouvrement, retirez délicatement l’excédent de liquide, placez la lamelle de recouvrement sur le Milieu de Montage Antidégradation avec DAPI sur la lame et scellez-la.

1.3.10 Analysez immédiatement l’échantillon avec un microscope à fluorescence, observez la fluorescence orangée à une longueur d’onde d’excitation/émission de 550/570nm; ou observez la fluorescence bleue de DAPI à une longueur d’onde d’excitation/émission de 356/451nm.

1. Echantillons de frottis cellulaires

2.1. Prétraitement de l’échantillon

2.1.1. Reprenez les cellules dans PBS à une concentration de  2×106 cellules/mL. Pipettez 50-100µL de suspension cellulaire sur une lame revêtue de polylysine et laissez-la sécher à l’air.

2.1.2. Immergez le frottis dans un récipient de coloration contenant 4% de paraformaldéhyde et incubez à 4°C pendant 25 minutes pour fixer les cellules.

2.1.3. Lavez avec une solution PBS 2-3 fois, chaque fois à température ambiante pendant 5 minutes.

2.1.4. Immergez les lames dans une solution de Triton X-100 à 0,2% et incubez à température ambiante pendant 5 minutes pour perméabiliser les cellules.

Remarque : Triton X-100 est recommandé pour la perméabilisation. La protéinase K peut également être utilisée pour la perméabilisation. Diluez une solution de Protéinase K à 2mg/mL avec PBS dans un rapport de 1:100 pour une concentration finale de 20µg/mL. Appliquez 100µL de la solution de Protéinase K diluée à chaque échantillonk, en vous assurant que la solution recouvre toute la zone de l’échantillon. Incubez à température ambiante pendant 5 minutes (l’optimisation du temps d’incubation est essentielle).

2.1.5 Lavez avec une solution PBS 2-3 fois, chaque fois à la température de chambre pendant 5 minutes.

2.1.6 Utilisez soigneusement du papier filtre pour absorber le liquide autour de l’échantillon sur les lamelles. Placez l’échantillon traité dans une cassette humide pour maintenir l’humidité.

2.2 (Etapes facultative). Témoin positif.

2.2.1. Préparez une cassette humide protégée de la lumière en plaçant des lingettes humides au fond et en transférant toutes les lames dans la cassette humide.

2.2.2. Diluez le Tampon DNase 10× en Tampon DNase 1× en utilisant de l’eau distillée déionisée dans un rapport de 1:10 pour une utilisation ultérieure.

2.2.3. Ajoutez 100µL de Tampon DNase I 1× aux échantillons perméabilisés et équilibrez à température ambiante pendant 5 minutes.

2.2.4. Diluez DNase I (2000U/mL) avec Tampon DNase I 1× pour une concentration finale de 20U/mL.

2.2.5. Absorbez délicatement l’excédent de liquide sur la lame en verre en utilisant du papier filtre. Appliquez 100µL de la solution de DNase I à 20U/mL à chaque échantillon témoin positif.

2.2.6. Incubez à 37°C pendant 10 minutes.

2.2.7. Absorbez délicatement l’excédent de liquide sur les lamelles et lavez avec PBS 3 fois, 5 minutes à chaque fois.

Remarque : Un récipient de coloration ou une plaque à puits séparé doit être utilisé pour le témoin positif. DNase I résiduelle sur le témoin positif peut provoquer des signaux faux positifs dasn le groupe expérimental.

2.2. Marquage et détection

2.3.1. Placez des lingettes humides au fond de la cassette humide et transférez toutes les lames dans la cassette humide.

2.3.2. Diluez Tampon d’Equilibration 5× en Tampon d’Equilibration 1× avec de l’eau distillée déionisée dans un rapport de 1:5.

2.3.3. Ajoutez 100µL de Tampon d’Equilibration 1× à l’échantillon dans la casette humide et équilibrez à température ambiante pendant 5-10 minutes.

2.3.4. Pendant l’équilibration, préparez la solution de marquage selon le tableau ci-dessous dans un bain de glace et dans les conditions de protection contre la lumière.

2.3.5. Après l’équilibration, retirez délicatement l’excédent de liquide. Ajoutez 50µL de solution de marquage à l’échantillon, en veillant à éviter la lumière.

Remarque : Volume de la solution de marquage : Pour les réactions couvrant une surface inférieure à 5cm², utilisez 50µL par réaction. Déterminez le volume total de la solution de marquage TdT nécessaire en multipliant 50µL par le nombre de réactions expérimentales et de témoins positifs. Pour les surfaces plus grandes, le volume de réactif peut être augmenté proportionnellement.

2.3.6. Fermez hermétiquement le couvercle de la cassette humide, évitez la lumière, empêchez les lamelles de recouvrement de sécher et incubez à 37°C pendant 60 minutes.

2.3.7. Sortez les lamelles de recouvrement, retirez délicatement l’excédent de liquide et lavez 2 fois avec PBS fraîche pendant 5 minutes à la température ambiante.

Remarque : Si le bruit de fond est trop élevé, afin de réduire le bruit de fond, après le lavage avec PBS, l’échantillon peut être lavé 3 fois avec PBS contenant 0,1% de Triton X-100 et 5mg/mL de BSA pendant 5 minutes, afin que les marqueurs libres non-réagis puissent être retirés.

2.3.8. Absorbez délicatement l’excédent de liquide sur les lamelles, ajoutez une goutte de Milieu de Montage Antidégradation avec DAPI (Cat. No. GC26283) sur l’échantillon.

2.3.9. Couvrez le Milieu de Montage Antidégradation avec DAPI sur la lame avec une lamelle de recouvrement pour sceller la lame.

2.3.10. Analyser immédiatement l’échantillon avec un microscope à fluorescence, observez la fluorescence orangée à une longueur d’onde d’excitation/émission de 550/570nm; ou observez la fluorescence bleue de DAPI à une longueur d’onde d’excitation/émission de 356/451nm.

3. Coupes de tissus en paraffine

3.1. Pré-traitement de l’échantillon

3.1.1. Immergez les coupes dans du xylène à température ambiante, effectuez le processus deux fois pendant 5-10 minutes à chaque fois pour éliminer complètement la paraffine.

Remarque : Le xylène est toxique et hautement volatil, effectuez cette étape dans un laboratoire dédié ou une hotte à évacuation. Une basse température peut affectuer l’efficacité du déparaffinage au xylène. Par conséquent, le temps de déparaffinage au xylène peut être étendu à 20 minutes lorsque la température ambiante est inférieure à 20°C.

3.1.2. Immergez les coupes dans de l’éthanol absolu, en les laissant tremper et en les rincant deux fois pendant 5 minutes à chaque fois à température ambiante.

3.1.3. Immergez les coupes dans de l’éthanol à 90%, 80% et 70% pendant 3 minutes chacune à température ambiante.

3.1.4. Trempez et lavez les coupes avec PBS et absorbez soigneusement l’excédent de liquide autour de l’échantillon sur les lames avec du papier fitre.

3.1.5. Diluez la solutionde Protéinase K à une concentration de 2mg/mL avec PBS dans un rapport de 1:100 pour obtenir une concentration finale de 20µg/mL. Ajoutez 100µL de la solution de Protéinase K diluée goutte à goutte à chaque échantillon pour couvrir toute la zone de l’échantillon et incubez pendant 15-30 minutes à température ambiante.

Remarque : Les temps de réaction peuvent varier en fonction du type de tissu ou de l’espèce. Une surexposition à la Protéinase K peut faire détacher les échantillons des lames lors des étapes suivantes, tandis qu’une perméabilisation insuffisante peut entraîner une faible efficacité de marquage. Une pré-expérience est recommandée pour optimiser les conditions de réaction.

3.1.6. Immergez et lavez les échantillons 3 fois avec PBS pendant 5 minutes à chaque fois. Retirez délicatement l’excédent de liquide et absorbez soigneusement le liquide autour de l’échantillon sur la lame avec du papier filtre. L’échantillon traité est conservé humide dans une cassette humide.

Remarque : Assurez-vous que la Protéinase K est complètement éliminée lors de cette étape, car toute enzyme résiduelle peut interférer significativement avec les réactions de marquage ultérieures.

3.2. Témoin positif (Etape Facultative)

Reportez-vous aux procédures décrites pour le témoin positif dans la section 2.2.

3.3. Marquage et Détection

Reportez-vous aux étapes de marquage et de détection décrites pour les échantillons de frottis cellulaires dans la section 2.3.

4.Coupes de tissus congelés

4.1. Prétraitement de l’échantillon

4.1.1. Placez les coupes de tissus congelés sur un rapport long et laissez-les sécher à température ambiante pendant 20 minutes.

4.1.2. Immergez les coupes dans une solution de paraformaldéhyde à 4% et fixez-les à température ambiante pendant 30 minutes.

4.1.3. Absorbez délicatement l’excédent de liquide sur les lames avec du papier filtre.

4.1.4. Immergez les coupes dans PBS et lavez-les deux fois pendant 5 minutes à chaque fois. Absorbez délicatement l’excédent de liquide sur les lames avec du papier filtre.

4.1.5. Déposez 100µL de Triton X-100 à 0,2% pour couvrir toute la zone de l’échantillon, perméabilisez à température ambiante pendant 15-30 minutes. Si la perméabilisation n’est pas suffisante, diluez la solution de Protéinase K avec PBS à une concentration de 2mg/mL pour obtenir une concentration finale de 20µg/ml dans un rapport de 1:100. Déposez 100µL de la solution de Protéinase K diluée sur chaque échantillon afin que la solution couvre toute la zone de l’échantillon et incubez pendant 10-30 minutes à température ambiante.

Remarque : Les temps d’incubation peuvent varier en fonction du type de tissu ou de l’espèce. Une surexposition à la Protéinase K peut faire détacher les échantillons des lames lors des étapes suivantes, tandis qu’une perméabilisation insuffisante peut entraîner une faible efficacité de marquage. Une pré-expérience est recommandée pour optimiser les conditions de réaction.

4.1.6. Immergez et lavez les échantillons 3 fois avec PBS pendant 5 minutes à chaque fois. Retirez délicatement l’excédent de liquide et absorbez soigneusement le liquide autour de l’échantillon sur la lame avec du papier filtre. L’échantillon traité est conservé humide dans une cassette humide.

Remarque : Assurez-vous que la Protéinase K est complètement éliminée lors de cette étape, car toute enzyme résiduelle peut interférer significativement avec les réactions de marquage ultérieures.

III.Précautions

1.5. Le tampon d’équilibration 5× contient un tensioactif, il se diffusera et s’écoulera donc lorsqu’il est ajouté à la lame d’un échantillon de frottis cellulaire/coupe. Il est recommandé de tracer un cercle autour de la zone de coloration avec un stylo PAP avant l’expérience.

2.Dissolvez le tampon d’équilibration 5× à la température ambiante avec votre expérience. Il est normal que le tampon d’équilibration 5× cristallise après fusion. Vortexez soigneusement avant utilisation.

3.Evitez de vortexer et les cycles de congélation-décongélation répétés à la fois pour le Mélange CY3-dUTP et l’Enzyme TdT. Avant utilisation, placez le Mélange CY3-dUTP sur la glace pour le dissoudre complètement. Une fois dissous, centrifugez et pipettez pour mélanger. L’Enzyme TdT est sensible à la température. Veuillez la stocker strictement à -20°C, la sortir avant utilisation et la remettre immédiatement après utilisation.

4.Lors de la préparation de la solution de marquage et de la solution de DNase I pour le témoin positif, il est recommandé de ne pas vortexer.

5.Veuillez garder les échantillons humides pendant l’expérience, car le séchage pourrait entraîner l’échec de l’expérience.

6.Ce Kit est uniquement destiné à une utilisation en recherche.

7.Veuillez prendre des précautions de sécurité et suivre les procédures d’opération des réactifs de laboratoire.

8.Les conditions recommandées dans ce manuel sont universelles. Les utilisateurs peuvent optimiser le temps de traitement de l’échantillon, la concentration dees réactifs et d’autres conditions en fonction des différents types d’échantillons et des résultats des pré-expériences, et sélectionner les conditions expérimentales les plus appropriées.

IV.Dépannage

产品组成：

功能属性：