Cell Counting Kit-8 (CCK-8)

Détermination du nombre de cellules

1. Inoculer la suspension cellulaire (100 μL/puits) dans une plaque de 96 puits. Pré-incuber la plaque dans un incubateur humidifié (par exemple, à 37°C, 5% de CO2).
2. Ajouter 10 μL de solution CCK8 dans chaque puits de la plaque. Veiller à ne pas introduire de bulles dans les puits, car elles interfèrent avec la lecture de l'O.D.
3. Incuber la plaque pendant 1 à 4 heures dans l'incubateur.
4. Mesurer l'absorbance à 450 nm à l'aide d'un lecteur de microplaques.

Essai de prolifération cellulaire et de cytotoxicité

1. Ensemencer les cellules dans une plaque de 96 puits à une densité de 10³-10⁴ cellules/puits dans 100 μL de milieu de culture à tester. Cultiver les cellules dans un incubateur à CO2 à 37°C pendant 24 heures.
2. Ajouter différentes concentrations des substances à tester à la plaque.
3. Incuber la plaque pendant une durée appropriée (par exemple, 6, 12, 24 ou 48 heures) dans l'incubateur.
4. Ajouter 10 μL de solution CCK8 dans chaque puits de la plaque à l'aide d'un pipeteur répétitif. Veiller à ne pas introduire de bulles dans les puits, car elles interfèrent avec la lecture de l'O.D.
5. Incuber la plaque pendant 1 à 4 heures dans l'incubateur.
6. Avant de lire la plaque, il est important de mélanger doucement sur un agitateur orbital pendant 1 minute pour assurer une distribution homogène de la couleur.
7. Mesurer l'absorbance à 450 nm à l'aide d'un lecteur de microplaques.

Analyse des données

Il existe plusieurs façons de faire une analyse statistique. Vous pouvez choisir d'utiliser les valeurs d'O.D. ou le nombre de cellules. Nous en proposons une.
Viabilité cellulaire (%) = [(As-Ab) / (Ac-Ab)] × 100
Taux d'inhibition (%) = [(Ac-As) / (Ac-Ab)] × 100
As = absorbance du puits expérimental (absorbance des cellules, du milieu, du CCK8 et des puits du composé à tester).
Ab = absorbance du puits témoin (absorbance des puits contenant le milieu et le CCK8).
Ac = absorbance du puits de contrôle (absorbance des puits contenant des cellules, du milieu et du CCK8).

Établissement d'une courbe standard

1. La plaque de comptage cellulaire compte le nombre de cellules dans la suspension cellulaire.
2. À l'aide du milieu, la suspension cellulaire est diluée selon un gradient de concentration, nécessitant généralement 5 à 7 gradients de concentration, avec plusieurs puits répliqués par groupe. Ensuite, inoculer les cellules. (Notez le nombre de cellules par puits. Si vous diluez la suspension cellulaire dans un tube, mélangez soigneusement les cellules à nouveau avant d'ajouter les puits à la plaque. Le volume de la suspension cellulaire dans chaque puits doit être le même.)
3. Incuber jusqu'à ce que les cellules soient adhérentes (généralement 2-4 heures), puis ajouter 10 μl de CCK8 par 100 μl de milieu. Continuer l'incubation pendant 1 à 4 heures, et mesurer l'absorbance à 450 nm avec un lecteur de microplaques. Établir une courbe standard avec le nombre de cellules comme coordonnée de l'axe X et la valeur de l'O.D. comme coordonnée de l'axe Y.
Le nombre de cellules de l'échantillon à tester peut être déterminé en se basant sur la courbe. Un prérequis pour utiliser cette courbe standard est que les conditions de culture soient les mêmes.

Précautions

1. Assurez-vous que le médicament et le CCK8 sont uniformément distribués dans le milieu.
2. Plus les cellules prolifèrent, plus la couleur est foncée ; plus la cytotoxicité est forte, plus la couleur est claire.
3. Pour les cellules adhérentes, au moins 1000 cellules par puits (100 μl de milieu). Pour les leucocytes, au moins 2500 cellules par puits (100 μl de milieu) sont nécessaires en raison de leur faible sensibilité. La plaque recommandée de 96 puits a un nombre maximum de cellules de 25 000 par puits. Si le test est effectué à l'aide d'une plaque de 24 puits ou de 6 puits, calculez le nombre correspondant de cellules par puits et ajustez le volume de CCK8 à 10% du volume total de liquide par puits.
4. Étant donné que le test CCK8 est basé sur l'activité des déshydrogénases dans les cellules vivantes, les conditions ou les produits chimiques qui affectent l'activité des déshydrogénases peuvent entraîner une différence entre le nombre réel de cellules viables et le nombre de cellules viables mesurées à l'aide de CCK8.
5. Le WST-8 peut réagir avec un agent réducteur pour former du formazan WST-8. Si un agent réducteur (comme certains antioxydants) est utilisé, il interférera avec le test. Si plus d'agent réducteur est présent dans le système à tester, il est nécessaire de l'éliminer.
6. Après 2 heures d'incubation, la valeur d'O.D. de fond est généralement de 0,1 à 0,2 unités.
7. Veillez à ne pas introduire de bulles d'air dans les puits, car elles interféreront avec la valeur de l'O.D.
8. Si vous souhaitez stériliser la solution CCK8, utilisez une solution filtrée sur une membrane de 0,2 μm.
9. Le temps d'incubation variera en fonction du type et de la quantité de cellules dans le puits. En général, les leucocytes sont moins colorés et peuvent nécessiter des temps d'incubation plus longs (jusqu'à 4 heures) ou un grand nombre de cellules (~10⁵ cellules/puits).
10. Si la suspension cellulaire présente une forte turbidité, mesurez et soustrayez la valeur d'O.D. de l'échantillon à 600 nm ou plus.
11. Le CCK8 ne peut pas être utilisé pour la coloration des cellules.
12. Le rouge de phénol dans le milieu n'affecte pas les résultats expérimentaux. L'absorbance du rouge de phénol peut être éliminée en soustrayant l'absorbance du fond dans le puits témoin pendant le calcul, de sorte qu'elle n'affectera pas la détection.
13. La toxicité du CCK8 est très faible. Après le test CCK8, les mêmes cellules peuvent être utilisées pour d'autres tests de prolifération cellulaire, tels que le test au violet de cristal, le test au rouge neutre ou le test de fluorescence de l'ADN. (Sauf si les cellules sont extrêmement rares, il n'est pas recommandé.)
14. Ce kit peut être utilisé dans E. coli mais pas dans les cellules de levure.
15. Avant de lire la plaque, vous pouvez mélanger doucement sur l'agitateur.
16. Nous recommandons l'inoculation des cellules dans les puits près du centre de la plaque. Le milieu dans le cercle le plus extérieur de puits s'évapore facilement et peut être rempli de PBS, d'eau ou de milieu.
17. Si vous n'avez pas de filtre à 450 nm. Vous pouvez également utiliser des filtres avec une absorbance comprise entre 430 et 490 nm, et des filtres à 450 nm pour une sensibilité optimale.
18. Mesurez l'absorbance à 450 nm. Si vous avez besoin de faire une mesure à double longueur d'onde, l'absorbance à 650 nm peut être déterminée comme longueur d'onde de référence.
19. La présence d'ions métalliques dans le médicament peut affecter la sensibilité du CCK8. Le chlorure de plomb, le chlorure de fer et le sulfate de cuivre à une concentration finale de 1 mM inhibent respectivement 5%, 15% et 90% de la réaction colorimétrique, réduisant ainsi la sensibilité. Si la concentration finale est de 10 mM, elle sera inhibée à 100%.