Annexin V-FITC/PI Apoptosis Kit

このスキームはただ目安として提供されているものであり、ニーズに応じて変更してください。

一、懸濁細胞の染色

1.懸濁細胞の染色

（1）細胞を1000 gで5分間遠心分離し、上清を捨て、適量のPBSで細胞を穏やかに再懸濁し、計数した。

注意：PBS再懸濁細胞は細胞を洗浄する役割もあり、その後のAnnexin V-FITCの結合が妨害されないようにすることができるので、このステップは省略できない。

（2）約5〜10×104個の細胞を取し、1000 gで5分間遠心分離し、上清を捨て、195μlのAnnexin V Binding Buffer軟質重懸濁細胞を加える。

（3）5μlのAnnexin V-FITCと10μlのPropidium Iodide染色液を加え、やさしく混ぜる。

（4）室温（20～25℃）で光を避けて10～20分間インキュベートする。

注：培養中に細胞を2〜3回再懸濁して染色の効果を改善することができる。

（5）サンプルを氷浴に移し、アルミニウム箔による光を避けることをお勧めする。

（6）フローサイトメトリーまたは蛍光顕微鏡を用いて染色結果を測定する。

2.壁貼り細胞の消化後検査について

（1）（重要）細胞培地を吸引し、適切な大きさの遠心管内に移す。

（2）（ポイント）PBSを用いて壁に貼り付けて培養した細胞を一度穏やかに洗浄し、適量のトリプシン細胞消化液を加えて細胞を消化し、室温で細胞の形が次第に丸くなるまでインキュベートし、緩くなり、軽く振ると細胞が脱落し、直ちに消化した細胞に（1）収集した細胞培地を加えて消化を中止し、細胞を静かに吹き落とす。

注意:

①このステップでは(1)で集めた細胞培養培地を使って消化を止めることをお勧めする。また、培地に懸濁しているアポトーシスや壊死した細胞を集めることもできる。

②トリプシン消化には適切に行う必要がある。消化時間が短すぎて、細胞は強く吹いてようやく脱落する必要があるため、細胞膜の損傷をもたらしやすく、それによって細胞壊死の偽陽性を引き起こす。また、消化に時間がかかりすぎると、同様に細胞膜が損傷して偽陽性を引き起こしやすく、さらに細胞膜上のホスホリニルセリンとAnnexin V-FITCの結合に影響を与え、アポトーシスの検出を妨げる可能性があります。

③トリプシン細胞の消化液にはEDTAをできるだけ含まな。Annexin VはCa 2＋依存するタンパク質であり、EDTAはCa 2＋をキレートすることができ、それによってAnnexin Vとホスファチジルセリン（PS）結合に影響し、実験結果に影響する。

④EDTAを含むトリプシンで細胞を消化する場合は、消化終了後、Annexin V-FITCを加える前にPBSで細胞を数回洗浄することを提案し、EDTAがアポトーシス検査に与える影響を除去することができる。

（3）細胞液を遠心管に移し、1000 gで5分間遠心分離し、上清を捨て、細胞を収集し、PBSで穏やかに細胞を再懸濁し、計数する。

注意：このステップはできるだけトリプシンを除去しなければならず、残ったトリプシンは後続に加えたAnnexin V-FITCを消化し分解し、染色の効果に影響を与える。

（4）約5〜10×104個の細胞を取り、1000 gで5分間遠心分離し、上清を捨て、195μlのAnnexin V Binding Buffer軟質重懸濁細胞を加える。

（5）5μlのAnnexin V−FITCと10μlのPropidium Iodide染色液を加え、穏やかに混ぜ、室温（20〜25℃）で10〜20分間光を避けてインキュベートする。

注：培養中に細胞を2〜3回再懸濁して染色の効果を改善することができる。

（6）サンプルを氷浴に移し、アルミニウム箔による光を避けることをお勧めする。

（7）フローサイトメトリーまたは蛍光顕微鏡を用いて染色結果を測定する。

二、壁貼り細胞の位置蛍光検査：

1、（選択）条件が許せば、アポトーシス誘導終了後に多孔質板を1000 gで5分間遠心分離することをお勧めする。

2、細胞培地を吸引・廃棄し、PBSを加えて1回洗浄する。条件が許す場合は、PBSを吸蔵する前に多孔質プレートを1000 gで5分間遠心分離することをお勧めします。

3、195μl Annexin V Binding Bufferを入れる。

4、5μlのAnnexin V-FITCと10μlのPropidium Iodideの染色液を加え、静かに混ぜ、室温（20-25℃）で10-20分間光を避けてインキュベートした。

5、サンプルを氷浴に移し、アルミニウム箔を用いた光を避ける処理をお勧めする。

6、蛍光顕微鏡で染色結果を検出する。

注意事項：

1、細胞は染色後できるだけ早く検査するべきで、1時間以内に検査を完了することを勧めて、細胞を結合液中に長く保存することをお勧めしない。

2、フローサイトメトリーに使用する場合、すぐに検出することができ、Annexin V-FITCは緑色蛍光で、最大励起/発光波長は525/530nmであり、488チャンネル励起でも使用できる。ヨウ化アクリリド(PI)は赤色蛍光で、核酸を結合させた最大励起光/発光波長は535/617nmである。

3、染色完了後に染色液を取り替えないで、そのまま装置で検査できる。すぐに検出できない場合は、遠心分離して染色液を除去し、PBSやAnnexin V Binding Bufferで細胞をを再懸濁することをお勧めする。

4、懸濁染色後に蛍光顕微鏡で細胞を検出する場合は、1000gで5分間遠心分離して細胞を集めて、50～100μlのAnnexin V Binding Bufferで穏やかに再懸濁し、塗抹後に蛍光顕微鏡で細胞を観察することをお勧めする。

5.フローサイトメトリーを初めて使用して検査を行う場合は、無染色、PI単染色、Annexin V-FITC単染色の3組の対照群を設定することを提案する。

6.フローサイトメトリーで検査する場合、Annexin V-FITC単独染色で過剰なPI偽陽性細胞が発見され、関連する設定やパラメーターを調整しても改善されないことが判明した場合は、Annexin V-FITCをPBSで3～10倍に希釈してから検査することができる。

7.本製品は細胞モデルのアポトーシス二重染色にのみ適しており、精子のアポトーシスの検出にも適しているが、組織サンプル中のアポトーシスの検出には使用できない。

8、Annexin V-FITCはホスファチジルセリン（PS）に結合することによりアポトーシス細胞を標識し、PSは異なる生物種間で比較的保守的であるため、本製品は異なる生物種の細胞におけるアポトーシス検出に適している。具体的な実験ステップは関連文献を参考することができる。

9.本品は抗体と一緒に細胞を染色することも可能ですが、別々に染色することをお勧めする。抗体染色終了後、アポトーシス検出のためにバッファーをAnnexin V Binding Bufferに変更することをお勧めする。

10.サンプルが血液由来の場合、血液中の血小板を除去しなければならず、血小板中のPSは実験結果を妨害する。

11.神経細胞膜は傷つきやすく、剥がれやすいため、偽陽性が出やすく、神経細胞のアポトーシスを検出するのに適していない。

12.操作中は静かに行い、遠心分離後はチューブの底に細胞があるか確認する必要がある。

13.すべての蛍光色素は消光の問題があるので、蛍光消光を遅くするために、実験中は光を避けるようにしてください。

14、安全と健康のため、実験着と使い捨ての手袋を着用してください。