Rhod-2 AM (Synonyms: Rhod-2 Acetoxymethyl ester)

このプランはあくまでもガイドであり、ご自分のニーズに合わせてご調整願います。

1.染色溶液の調製

（1）貯蔵液の調製：質の高い無水DMSOで、濃度が1-10mMのAMエステル貯蔵液を調製する；

注：

①未使用の貯蔵液を小分けし、暗闇で、-20℃または-80℃で保存し、繰り返した冷凍と解凍を避ける；

②アセトキシメチルエステル（AM）は簡単に湿気を吸収する。冷蔵庫から取り出した後は、開封する前に乾燥な環境で室温に置いてください。粉末がチューブの底に沈むことを確保するためには、開封の前に短く遠心分離してください。

（2）作業溶液の調製：適切な緩衝液（例えば無血清と無フェノールレッド培地またはPBS）で貯蔵液を希釈し、濃度が1-10μMの作業溶液を調製する。

注：

①AMエステル染色作業溶液を調製する時は、適切な量の20%のPluronic F-127溶液を貯蔵液に添加し、AMプローブの水溶性を増強させる；

②Pluronic F-127はAMプローブを溶液で凝集することを阻止し、細胞へのプローブのより良い進入を促進する。しかし、Pluronic F-127はAMプローブの安定性を減らせるので、作業溶液を調製する時だけ添加することを推奨する。長期保存のために貯蔵液を添加することを推奨しない。

③20% (w/v) Pluronic F-127貯蔵液の調製：100mgのPluronic F-127粉末(Cat. No.: GB30090)の重量を測り、500μlのDMSOを添加し、40-50℃で20-30分間加熱し、室温で保存する。結晶が沈殿すれば、使用を影響せずに再加熱し、溶解することができる；

④（選択性）GLPBIOは溶解されたPluronic F-127（DMSOに20%の溶液）、製品番号：GB30091を提供する；

⑤等量の20%のPluronic F-127溶液を貯蔵液に添加し、よってPluronic F-127の最終濃度は約0.02%になる；

⑥実際の条件に合わせて作業液の濃度を調節し、繰り返した冷凍と解凍を避けるためには直ちに調製してください。

2.細胞懸濁染色

（1）懸濁細胞：4℃、1000gで3-5分間遠心分離し、上清を廃棄し、PBSまたはその他の緩衝液で、1回に5分間、2回洗浄する；

（2）接着細胞：PBSまたはその他の緩衝液で二回洗浄し、トリプシンを添加して細胞を消化し、完了後は1000gで3-5分間遠心分離する；

（3）染料作業溶液を添加し、細胞を再懸濁し、室温または室温以下で暗闇で20分から2時間培養する。異なる細胞の最適の培養時間はそれぞれ異なるので、ご自分の実験ニーズに合わせてご調整願います。

注：

①殆どの細胞におけるAMエステル染料の推奨作業濃度は4-5μMであり、特定の濃度は実験の受容に応じて最適化する必要がある。オーバーロードによる細胞毒性を避けるためには、有効な結果に基づき可能な限り最小のプローブ濃度を使うことを推奨する；

②（選択的）細胞に有機アニオントランスポーターが含まれていれば、脱エステル化プローブの漏洩レベルを減らすためには、プロベネシド（GC16825, Probenecid, 1-2.5mM）またはスルフィンピラゾン（GC11049, Sulfinpyrazone, 0.1-0.25mM）を細胞培地に添加する必要があるかもしれない。プロベネシドまたはスルフィンピラゾンの貯蔵液はアルカリ性であるため、pHは培地の添加後に再調整する必要がある；

③血清含有の培地が使われたら、血清ラクトナーゼはAMを分解し、よって染料ローディング効果を減らす；フェノールレッド含有の培地はバックグラウンド値を僅かに高めることができる。染色作業液を添加する前に、細胞を二三回洗浄することを推奨する；

④プローブローディング温度を低くすることは、プローブの区画化を減らせる可能性がある；

⑤染色前、水素化ホウ素ナトリウム(NaBH4)を使ってのRhod-2 AMの化学還元は、この染料のミトコンドリア局在化を増強することが発見された。僅かに過剰した固定の水素化ホウ素ナトリウム、またはメタノール溶液を添加し、10分間培養し、または混合液が無色になりはじめるまで培養する。

（4）培養後、1000gで5分間遠心分離し、染色溶液を除去し、PBSまたはその他の緩衝液を添加し、2-3回洗浄し、残留のプローブを除去する；

（5）室温で更に30分間培養し、細胞内AMの完全な脱エステル化を確保する。

3.細胞接着染色

（1）接着細胞を無菌カバーガラスに培養する；

（2）カバーガラスを培地から除去し、余分の培地を吸い出し、カバーガラスを湿った環境で置く；

（3）100μLの染料作業溶液をカバーガラスに一角から添加し、ゆっくり振り、全ての細胞が染料に均一に覆われることにする；

（4）室温または室温以下で暗闇で20分から2時間培養する。異なる細胞の最適の培養時間はそれぞれ異なるので、ご自分の実験ニーズに合わせてご調整願います。

（5）培養後、染料作業溶液を廃棄し、カバーガラスをPBSまたはその他の緩衝液で2から3回洗浄する；

（6）室温で30分間培養する。

4.顕微鏡検出：Rhod-2 AMの最大励起/発光波長は557/581nmである。

注意事項：

1）蛍光染料は全て消光の問題がある。蛍光の消光を遅らせるためには、できるだけ光から遠ざけてください。

2）安全と健康のために、白衣と使い捨ての手袋を装着してください。