Annexin V-FITC/PI Apoptosis Kit

이 계획은 단지 가이드일 뿐만 아니라 구체적인 필요에 따라 수정하시기 바랍니다.

I. 세포 정지 염색:

i. 정지 세포 염색

1.세포를 1000g로 5분간 원심 분리하고 상청액을 버리고 PBS로 부드럽게 세포를 소생시키고 흩으세요.

참고: PBS로 세포를 소생은 것은 세포를 세정하는 역할을 하며 후속 Annexin V-FITC 결합이 방해받지 않도록 합니다. 이 단계는 생략할 수 없습니다.

2.약 5-10×104개의 세포를 1000g로 5분간 원심 분리하고 상청액을 버리십시오. Annexin V 결합 버퍼 195μl을 추가하여 세포를 살짝 다시 흩으세요.

3.Annexin V-FITC 5μl과 프로피디움 아이오드 염색액 10μl을 추가하여 살짝 혼합하시기 바랍니다.

4.방열을 피하고 실온 (20-25℃)에서 10-20분 동안 배양해 주시기 바랍니다.

참고: 배양한 기간 동안 세포를 2-3회 다시 흩어져 염색 결과를 개선할 수 있습니다.

5.샘플을 얼음욕조에 옮깁니다. 빛으로부터 보호하기 위해 알루미늄 호일을 사용하는 것이 좋습니다.

6. 유세포분석기나 형광 현미경을 사용하여 염색 결과를 탐지합니다.

ii. 착착 세포의 소화 후 탐지:

1.(중요 단계) 세포 배양 기재를 적당한 크기의 중심 분리관로 옮깁니다.

2. (키 단계) PBS를 사용하여 착착 배양세포를 부트럽게 세척한 후 적당량의 트립신 세포 소화액을 추가하여 세포를 소화시키고 실온에서 점차 세포가 점차 둥글어지고 흔들리며 살포되면 살포된 세포에 즉시 1단계에서 수집한 세포 배양 기재를 추가하여 소화를 중단하고 세포를 부드럽게 피펫으로 씻어냅니다.

공지:

① 배양 액에 정지된 세포자멸사 또는 괴사된 세포를 수집하기 위해서는1단계에서 수집한 세포 배양 액을 사용하여 소화를 중단하는 것이 좋습니다.

② 트립신 소화는 적당해야 합니다. 소화 시간이 너무 짧으면 세포가 살포되기 위해 세포를 세게 불어내야 하며 세포막 손상을 초래하여 세포 괴사라의 잘못된 양성 결과를 일으킬 수 있습니다. 소화 시간이 너무 길면 세포막 손상과 가짜 긍정 결과가 발생할 수 있고 심지어 Annexin V-FITC가 세포막의 인산화 셀리놀에 결합하는 것을 방해하여 세포 조사성을 탐지하는 데 간섭을 줍니다.

③ 트립신 소화액에 EDTA를 사용하는 것을 피해 주시기 바랍니다. Annexin V는 Ca2+에 의존하는 단백질입니다. EDTA는 Ca2+를 첨가하여 Annexin V와 인산화 셀리놀(PS)의 결합을 방해하고 실험 결과에 영향을 미칩니다.

④ EDTA를 포함하는 트립신으로 세포를 소화할 경우 Annexin V-FITC를 추가하기 전에 PBS로 세포를 여러 번 세척하여 EDTA가 조사성 탐지에 미치는 영향을 제거하는 것이 좋습니다.

3.세포 용액을 원심 분리관으로 옮겨 1000g로 5분간 중심 분리하고 상청액을 버리고 세포를 수집하여 PBS로 세포를 소생시키고 수를 셉니다.

참고: 이 단계에서 가능한 한 많은 트립신을 제거해 주시기 바랍니다. 남은 트립신은 후속으로 추가된 Annexin V-FITC를 소화하고 분해하여 염색 효과에 영향을 미칩니다.

4.약 5-10×104개의 세포를 1000g로 5분간 중심 분리하고 상청액을 버리고 195μl Annexin V 결합 버퍼를 추가하여 세포를 살짝 다시 흩으세요.

5.5μl Annexin V-FITC와 10μl 프로피디움 아이오드 염색액을 추가하여 부드럽게 혼합하고 실온 (20-25℃)에서 어둠에서 10-20분 동안 걸립시오.

참고: 큐레이션 기간 동안 세포를 2-3회 소생시켜 염색 결과를 개선할 수 있습니다.

6.샘플을 얼음욕조에 옮깁니다. 빛으로부터 보호하기 위해 알루미늄 호일을 사용하는 것이 좋습니다.

7. 유세포분석기나 형광현미경을 사용하여 염색 결과를 탐지합니다.

II. 부착형 세포의 현장 형광 검출:

1.(선택 사항) 조건이 허락되면 조사성 유도 후 멀티 웰 판을 1000g으로 5분간 원심 분리하는 것이 좋습니다.

2.세포 배양액을 흡인하고 PBS를 추가하여 한 번 세척합니다. 조건을 허락되면 PBS를 흡인하고 버리기 전에 멀티 웰 판을 1000g으로 5분간 원심 분리하는 것이 좋습니다.

3.195μl Annexin V 결합 버퍼를 추가합니다.

4. 5μl Annexin V-FITC와 10μl 프로피디움 아이오드 염색액을 추가하여 부드럽게 혼합하고 실온 (20-25°C)에서 빛을 피해 10-20분 동안 걸립니다.

5.샘플을 얼음욕조에 옮깁니다. 빛으로부터 보호하기 위해 알루미늄 호일을 사용하는 것이 좋습니다.

6. 형광 현미경을 사용하여 염색 결과를 탐지합니다.

주의사항:

1.세포는 염색 후 가능한 빨리 테스트를 진행해야 합니다. 1시간 내에 테스트를 완료하는 것이 좋습니다. Annexin V 결합 버퍼에 세포를 긴 시간동안 저장한 것은 권장되지 않습니다.

2. 유세포 검출에 사용할 경우 즉시 테스트를 진행할 수 있습니다. Annexin V-FITC는 녹색 형광로 최대 흥분/발산 파장이 525/530nm이며, 488 채널로도 흥분할 수 있습니다; 프로피디움 아이오드(PI)는 빨간색 형광이며 핵산과 결합 후의 최대 자극/방출 파장은 535/617nm입니다.

3. 염색 후 염색 용액을 변경하지 않고 직접 세포를 테스트할 수 있습니다. 즉시 테스트를 할 수 없는 경우 염색 용액을 제거하기 위해 중심 분리하고 세포를 PBS나 Annexin V 결합 버퍼에 다시 흩어주는 것이 좋습니다.

4.현탁 염색 후 형광 현미경에서 세포를 탐지할 경우 1000g로 5분간 원심 분리하여 세포를 수집하고 50-100μl Annexin V 결합 버퍼에 부드럽게 수생해져 형광 현미경에서 관찰하기 전에 보시는 것이 좋습니다.

5. 유세포 라인을 처음 사용하여 탐지할 때3개 그룹을 설정하는 것이 좋습니다: 염색하지 않은 그룹, PI 만 염색된 그룹, Annexin V-FITC 만 염색된 그룹.

6. 흐름 사이토메트리를 사용하여 탐지할 때 Annexin V-FITC 만 사용하여 염색했을 때 PI false-positive 세포가 너무 많고 관련 설정과 매개변수를 조정하여 개선할 수 없을 경우 탐지 전에 Annexin V-FITC를 PBS로 3-10배 희석할 수 있습니다.

7.이 제품은 세포 모델에서의 조사성 두중 염색에만 적합합니다. 정자 조사성을 탐지하는 데에도 적합하지만 조직 샘플에서의 조사성을 탐지하는 데는 사용할 수 없습니다.

8.Annexin V-FITC는 인산화 셀리놀(PS)과 결합하여 조사성 세포를 표시합니다. PS는 다른 종에서 상대적으로 보존됩니다. 그리고 제품은 서로 다른 종의 세포 조사성 탐지에 적합합니다. 관련 실험 단계에 대해서는 관련 문헌을 참고하시기 바랍니다.

9. 이 제품은 항체와 세포를 염색하는 데 사용할 수 있지만 별도로 염색하는 것이 좋습니다. 항체 염색 후 조사성 탐지용 Annexin V 결합 버퍼로 버퍼를 교체하는 것이 권장됩니다.

10.샘플이 혈액에서 나온 경우 혈액의 혈소판을 반드시 제거해야 합니다. 혈소판의 PS는 실험 결과에 간섭할 수 있습니다.

11.신경 세포막은 쉽게 손상되고 상변하여 잘못된 양성이 생길 수 있습니다.그리고 이 제품은 신경 세포 조사성을 탐지하는 데 적합하지 않습니다.

12.조작 시 반드시 경조로 진행하시고, 중심 분리 후 튜브 바닥에 세포가 있는지 확인해 주세요.

13. 형광 염료는 모두 끈기 현상이 있습니다. 실험 과정 중 빛을 피함으로써 형광억제를 늦추어 주세요.

14.안전과 건강을 위해 실험복과 일회용 장갑을 착용하시기 바랍니다.