Cell Counting Kit-8 (CCK-8)

세포 수 결정

1. 세포 흩음액(100 μL/well)을 96웰 판에 접종한다. 습한 배양 상자에서 판을 사전 배양한다(예: 37OC CO2 조건).

2. 판의 각 웰에 CCK8 용액 10 μL를 붓은다. 공중에 공기가 들어가지 않도록 주의해야 하며 이는 O.D. 읽기에 간섭을 준다.

3. 배양 상자에서 판을 1-4시간 동안 배양한다.

4. 마이크로플레이트 판독기로 450nm에서 흡광도를 측정한다.

세포 증식 및 세포 독성 검사

1. 96-웰 판에 103-104개의 세포 밀도로 세포를 심어, 100 μL의 검사할 배양액을 사용한다. 37도의 CO2 배양 상자에서 24시간 동안 세포를 배양한다.

2. 판에 다양한 농도의 검사할 물질을 추가한다.

3. 배양 상자에서 적절한 시간 동안 판을 배양한다 (예: 6, 12, 24 또는 48시간).

4. 반복 사용형 파이펫을 사용하여 판의 각 웰에 10 μL의 CCK-8 용액을 추가한다. 공기 버블이 O.D. 읽기에 간섭을 일으키므로 각 웰에 공기 버블이 들어가지 않도록 주의한다.

5. 배양 상자에서 판을 1-4시간 동안 배양한다.

6. 판을 읽기 전에 중요한 것은 회전 흔들기기에서 1분 동안 부드럽게 흔들어 색의 균일한 분포를 보장하는 것이다.

7. 마이크로플레이트 판독기로 450nm에서 흡광도를 측정한다.

데이터 분석

통계 분석을 하는 방법은 여러 가지가 있다. O.D. 값을 사용하거나 세포 수를 사용하는 것을 선택할 수 있다. 그 중 하나를 제공한다.

세포 생존율(%) = [(As - Ab) / (Ac - Ab)] × 100

억제율(%) = (Ac - As) / (Ac - Ab) × 100

As = 실험 well의 흡광도 (시험 화합물의 웰에서의 세포, 배양액, CCK8의 흡광도)

Ab = 빈 well의 흡광도 (배양액과 CCK8이 포함된 웰의 흡광도).

Ac = 대조 well의 흡광도 (세포, 배양액, CCK8이 포함된 웰의 흡광도).

표준 곡선 만들기

1. 세포 계수판은 세포 흩음액의 세포 수를 계산한다.

2. 배양액을 사용하여 세포 흩음액을 농도 그래디언트로 희석하고 일반적으로 5-7 개의 농도 그래디언트가 필요하며 각 그룹마다 여러 개의 반복 웰이 필요한다. 그런 다음 세포를 접종한다. (튜브에서 세포 흩음액을 희석할 때 각 well의 세포 수를 기록하고, 판에 웰을 추가하기 전에 세포를 다시 세심하게 혼합한다. 각 well의 세포 흩음액의 용량은 동일해야 한다.)

3. 세포가 부착될 때까지 배양한다(보통 2-4시간), 그리고 100 μL 배양액당 10 μL CCK8을 추가한다. 1-4시간 동안 계속 배양하고, 마이크로플레이트 판독기로 450nm에서 흡광도를 측정한다. 세포 수를 X축 좌표로, 광도(O.D.) 값을 Y축 좌표로 표준 곡선을 만든다.

곡선을 기반으로 검사할 샘플의 세포 수를 결정할 수 있다. 이 표준 곡선을 사용하는 전제 조건은 배양 조건이 동일하다는 것이다.

주의사항

1. 약물과 CCK8이 배양액에 고르게 분포되었는지 확인한다.

2. 세포가 더 많이 증식할수록 색깔이 깊어지고, 세포 독성이 강할수록 색깔이 연해진다.

3. 부착 세포의 경우, 각 well에 최소 1000개의 세포(100 pl 배양액)가 필요한다. 백혈구의 경우 감도가 낮아, 각 well에 최소 2500개의 세포(100 pl 배양액)가 필요한다. 24 well 판 또는 6 well 판을 사용하여 테스트를 수행하는 경우, 96 well 판의 각 well에 대해 최대 25,000개의 세포 세기, 각 well당 CCK8의 양을 well의 총 유동체량의 10%로 조정한다.

4. CCK-8 실험은 살아있는 세포의 디효드로게나스 활동을 기반으로 하므로, 디효드로게나스 활동에 영향을 미치는 조건이나 화학 물질은 실제 활성 세포 수와 CCK-8을 사용하여 측정된 수의 차이를 초래할 수 있다.

5. WST-8은 환원제와 반응하여 WST-8 포르마잔을 형성할 수 있다. 환원제(예: 일부 항산화제)를 사용하면 테스트가 방해될 수 있다. 테스트 대상 시스템에 더 많은 환원제가 포함되어 있다면 제거해야 한다.

6. 배양 2시간 후 배경 광도(O.D.) 값은 일반적으로 0.1-0.2 단위 사이다.

7. 공기 버블이 구멍에 들어가면 O.D. 값을 방해할 수 있으므로 주의해야 한다.

8. CCK8 용액을 소독하려면 0.2 um 필터로 용액을 사용한다.

9. 구멍의 세포 종류와 양에 따라 배양 시간은 달라질 수 있다. 일반적으로 백혈구는 색이 옅어서 더 긴 배양 시간(최대 4시간)이나 많은 세포 수(~105 cells/well)가 필요할 수 있다.

10. 세포 흩음액에 높은 흐림도가 있는 경우, 계산 시 샘플의 600nm 또는 그 이상의 파장에서의 흡광도 값을 측정하고 빼준다.

11. CCK8은 세포 염색에 사용할 수 없다.

12. 배양액의 페놀 레드가 실험 결과에 영향을 주지 않는다. 계산 시 빈 구멍의 배경 흡광도를 빼면 페놀 레드의 흡광도를 제거할 수 있고 감지에 영향을 미칠 수 있다.

13. CCK8의 독성은 매우 낮은다. CCK8 실험이 끝난 후 동일한 세포를 크리스탈 보라 염색, 중성 빨강 염색 또는 DNA 유기광 측정 등 다른 세포 증식 측정에 사용할 수 있다. (세포가 매우 드물 경우를 제외하고는 권장되지 않는다.)

14. 이 키트는 대장균에서 사용할 수 있지만 효모세포에서는 사용할 수 없다.

15. 판을 읽기 전에 쉐이커에서 부드럽게 혼합할 수 있다.

16. 우리는 판의 중앙 근처의 구멍에 세포를 접종하는 것을 추천한다. 가장 바깥쪽 고리의 구멍에 있는 배양액은 증발하기 쉬우며 PBS, 물 또는 배양액으로 채울 수 있다.

17. 450nm 필터가 없을 경우 430에서 490nm 사이의 필터를 사용할 수 있으며 450nm 필터를 사용하면 최적의 감도를 얻을 수 있다.

18. 450nm에서의 흡광도를 측정하고 이중 파장 측정을 해야 한다면 650nm에서의 흡광도를 참조 파장으로 결정할 수 있다.

19. 약물에 있는 금속 이온은 CCK8의 감도에 영향을 미칠 수 있다. 납화물, 철화물 및 황산구리가 최종 농도가 1mM일 때 각각 5%, 15%, 90%의 색 반응을 억제하여 감도를 낮추고, 최종 농도가 10mM이면 100% 억제된다.