Annexin V-FITC/PI Apoptosis Kit

Este plan es solo una guía; por favor, modifíquelo según sus necesidades específicas.

I. Tinción de suspensión celular:

i. Tinción de células en suspensión

1. Centrifugar las células a 1000g durante 5 minutos, descartar el sobrenadante y resuspender suavemente las células en una cantidad adecuada de PBS y contar.

Nota: La resuspensión de las células en PBS también desempeña un papel en el lavado de las células para garantizar que la posterior unión de Annexin V-FITC no se vea interferida. Este paso no puede omitirse.

2. Tomar aproximadamente 5-10×10^4 células, centrifugar a 1000g durante 5 minutos, descartar el sobrenadante y agregar 195μl de Buffer de Unión Annexin V para resuspender suavemente las células.

3. Agregar 5μl de Annexin V-FITC y 10μl de solución de tinción de Ioduro de Propidio y mezclar suavemente.

4. Incubar a temperatura ambiente (20-25℃) alejadas de la luz durante 10-20 minutos.

Nota: Durante la incubación, las células pueden resuspenderse 2-3 veces para mejorar los resultados de la tinción.

5. Transferir la muestra a un baño de hielo. Se recomienda usar papel de aluminio para protegerla de la luz.

6. Utilizar citometría de flujo o microscopía de fluorescencia para detectar los resultados de la tinción.

ii. Para la detección posterior a la digestión de células adherentes:

1. (Paso importante) Aspirar el medio de cultivo celular y transferirlo a un tubo de centrifugado de tamaño adecuado.

2. (Paso clave) Usar PBS para lavar suavemente las células adherentes cultivadas una vez, agregar una cantidad adecuada de solución de digestión de tripsina para digerir las células, e incubar a temperatura ambiente hasta que las células se vuelvan gradualmente redondas y sueltas. Cuando las células se desprendan al agitar suavemente, agregar inmediatamente el medio de cultivo celular recogido en el paso 1 para detener la digestión, y pipetear suavemente las células hacia abajo.

Aviso:

① Para recolectar células apoptóticas o necróticas suspendidas en el medio de cultivo, se recomienda usar el medio de cultivo celular recogido en el paso 1 para detener la digestión en este paso.

② La digestión con tripsina debe ser adecuada. Si el tiempo de digestión es demasiado corto, será necesario agitar enérgicamente las células para que se desprendan, lo cual puede dañar la membrana celular y generar falsos positivos de necrosis celular. Si el tiempo de digestión es demasiado largo, también es fácil dañar la membrana celular, lo que podría causar falsos positivos e incluso afectar la unión de la fosfatidilserina de la membrana con Annexin V-FITC, interfiriendo con la detección de apoptosis celular.

③ Tratar de evitar el EDTA en la solución de digestión con tripsina. Annexin V es una proteína dependiente de Ca2+. El EDTA puede quelar Ca2+, interfiriendo con la unión de Annexin V y fosfatidilserina (PS), lo que afectaría los resultados del experimento.

④ Si se utiliza tripsina con EDTA para digerir las células, se recomienda lavar varias veces las células con PBS después de la digestión y antes de agregar Annexin V-FITC para eliminar el efecto del EDTA en la detección de apoptosis.

3. Transferir la solución celular a un tubo de centrifugado, centrifugar a 1000g durante 5 minutos, descartar el sobrenadante, recolectar las células y resuspender suavemente las células en PBS y contar.

Nota: En este paso, intente eliminar la mayor cantidad posible de tripsina. La tripsina residual puede digerir y degradar Annexin V-FITC, afectando el resultado de la tinción.

4. Tomar aproximadamente 5-10×10^4 células, centrifugar a 1000g durante 5 minutos, descartar el sobrenadante, agregar 195μl de Buffer de Unión Annexin V y resuspender suavemente las células.

5. Agregar 5μl de Annexin V-FITC y 10μl de solución de tinción de Ioduro de Propidio, mezclar suavemente y incubar a temperatura ambiente (20-25℃) en la oscuridad durante 10-20 minutos.

Nota: Durante la incubación, las células pueden resuspenderse 2-3 veces para mejorar los resultados de la tinción.

6. Transferir la muestra a un baño de hielo. Se recomienda usar papel de aluminio para protegerla de la luz.

7. Utilizar citometría de flujo o microscopía de fluorescencia para detectar los resultados de la tinción.

II. Detección de fluorescencia in situ en células adherentes:

1. (Opcional) Si las condiciones lo permiten, se recomienda centrifugar la placa de pocillos múltiples a 1000g durante 5 minutos después de la inducción de apoptosis.

2. Aspirar el medio de cultivo celular, agregar PBS y lavar una vez. Si las condiciones lo permiten, se recomienda centrifugar la placa de pocillos múltiples a 1000g durante 5 minutos antes de aspirar y descartar el PBS.

3. Agregar 195μl de Buffer de Unión Annexin V.

4. Agregar 5μl de Annexin V-FITC y 10μl de solución de tinción de Ioduro de Propidio, mezclar suavemente y incubar a temperatura ambiente (20-25°C) alejadas de la luz durante 10-20 minutos.

5. Transferir la muestra a un baño de hielo. Se recomienda usar papel de aluminio para protegerla de la luz.

6. Utilizar un microscopio de fluorescencia para detectar los resultados de la tinción.

Precauciones:

1. Las células deben ser evaluadas lo antes posible después de la tinción. Se recomienda completar la prueba dentro de 1 hora. No se recomienda almacenar las células en el Buffer de Unión Annexin V durante mucho tiempo.

2. Si se utiliza para la detección por citometría de flujo, se puede realizar la prueba de inmediato. Annexin V-FITC es fluorescente verde, con una longitud de onda máxima de excitación/emisión de 525/530nm, y también puede excitarse con canales de 488; el Ioduro de Propidio (PI) es fluorescente rojo, con una longitud de onda máxima de excitación/emisión de 535/617nm después de unirse al ácido nucleico.

3. Después de la tinción, puede evaluar las células directamente sin cambiar la solución de tinción. Si no puede realizar la prueba de inmediato, se recomienda centrifugar para eliminar la solución de tinción y resuspender las células en PBS o en el Buffer de Unión Annexin V.

4. Si las células se detectan bajo un microscopio de fluorescencia después de la tinción en suspensión, se recomienda recolectar las células mediante centrifugación a 1000g durante 5 minutos, resuspender suavemente las células en 50-100μl de Buffer de Unión Annexin V y observar bajo el microscopio de fluorescencia después de hacer una extensión.

5. Al utilizar el citómetro de flujo por primera vez, se recomienda establecer tres grupos de control: sin tinción, tinción simple con PI y tinción simple con Annexin V-FITC.

6. Al utilizar citometría de flujo, si se encuentran demasiadas células con PI falsos positivos cuando se tiñe solo con Annexin V-FITC y no se puede mejorar ajustando la configuración y parámetros relevantes, puede diluir Annexin V-FITC 3-10 veces con PBS antes de la detección.

7. Este producto es adecuado solo para la doble tinción de apoptosis en modelos celulares. También es adecuado para detectar apoptosis en espermatozoides, pero no se puede usar para detectar apoptosis en muestras de tejidos.

8. Annexin V-FITC marca células apoptóticas combinándose con la fosfatidilserina (PS). La PS está relativamente conservada entre diferentes especies. Por lo tanto, este producto es adecuado para la detección de apoptosis en células de diferentes especies. Para los pasos experimentales relevantes, consulte la literatura correspondiente.

9. Este producto puede usarse para teñir células junto con anticuerpos, pero se recomienda realizar la tinción por separado. Se recomienda reemplazar el buffer por el Buffer de Unión Annexin V para la detección de apoptosis después de la tinción con anticuerpos.

10. Si la muestra proviene de sangre, se deben eliminar las plaquetas, ya que la PS en las plaquetas interferirá con los resultados experimentales.

11. La membrana de las células nerviosas es fácilmente dañada y expuesta, lo que provoca falsos positivos. Por lo tanto, este producto no es adecuado para detectar apoptosis en células nerviosas.

12. Asegúrese de ser cuidadoso durante la manipulación y confirme si hay células en el fondo del tubo después de la centrifugación.

13. Los colorantes fluorescentes tienen problemas de extinción. Intente evitar la exposición a la luz durante el experimento para ralentizar la extinción de la fluorescencia.

14. Para su seguridad y salud, utilice una bata de laboratorio y guantes desechables.