Cell Counting Kit-8 (CCK-8)

Determinación del Número de Células
1. Inocular la suspensión celular (100 μL/pozo) en una placa de 96 pozos. Preincubar la placa en un incubador humidificado (por ejemplo, a 37°C, 5% CO2).
2. Añadir 10 μL de solución CCK8 a cada pozo de la placa. Tener cuidado de no introducir burbujas en los pozos, ya que interfieren con la lectura de O.D.
3. Incubar la placa durante 1 a 4 horas en el incubador.
4. Medir la absorbancia a 450 nm utilizando un lector de microplacas.
Ensayo de Proliferación Celular y Citotoxicidad
1. Sembrar las células en una placa de 96 pozos a una densidad de 10^3-10^4 células/pozo en 100 μL de medio de cultivo a probar. Cultivar las células en un incubador de CO2 a 37°C durante 24 horas.
2. Añadir diversas concentraciones de las sustancias a probar a la placa.
3. Incubar la placa durante un tiempo apropiado (por ejemplo, 6, 12, 24 o 48 horas) en el incubador.
4. Añadir 10 μL de solución CCK8 a cada pozo de la placa utilizando un pipeteador repetidor. Tener cuidado de no introducir burbujas en los pozos, ya que interfieren con la lectura de O.D.
5. Incubar la placa durante 1 a 4 horas en el incubador.
6. Antes de leer la placa, es importante mezclar suavemente en un agitador orbital durante 1 minuto para asegurar una distribución homogénea del color.
7. Medir la absorbancia a 450 nm utilizando un lector de microplacas.
Análisis de Datos
Existen varias maneras de realizar el análisis estadístico. Se puede elegir utilizar valores de O.D. o números de células. Ofrecemos una de ellas.
Viabilidad celular (%) = [(As-Ab) / (Ac-Ab)] × 100
Tasa de inhibición (%) = [(Ac-As) / (Ac-Ab)] × 100
As = absorbancia del pozo experimental (absorbancia de células, medio, CCK8 y pozos del compuesto de prueba).
Ab = absorbancia del pozo en blanco (absorbancia de pozos que contienen medio y CCK8).
Ac = absorbancia del pozo de control (absorbancia de pozos que contienen células, medio y CCK8).
Elaboración de una Curva Estándar
1. La placa de conteo de células cuenta el número de células en la suspensión celular.
2. Utilizando el medio, la suspensión celular se diluye a una gradiente de concentración, generalmente requiriendo de 5 a 7 gradientes de concentración, varios pozos replicados por grupo. Luego se inoculan las células. (Nota el número de células por pozo. Si se diluye la suspensión celular en un tubo, mezclar cuidadosamente las células nuevamente antes de agregar los pozos a la placa. El volumen de la suspensión celular en cada pozo debe ser el mismo).
3. Incubar hasta que las células estén adheridas (generalmente 2-4 horas), luego añadir 10 μL de CCK8 por 100 μL de medio. Continuar la incubación durante 1-4 horas y medir la absorbancia a 450 nm con un lector de microplacas. Elaborar una curva estándar con el número de células como coordenada del eje X y el valor de O.D. como coordenada del eje Y.
El número de células de la muestra a probar se puede determinar con base en la curva. Un requisito previo para utilizar esta curva estándar es que las condiciones de cultivo sean las mismas.
Precauciones
1. Asegurarse de que el fármaco y el CCK8 estén distribuidos uniformemente en el medio.
2. Cuantas más células proliferen, más oscuro será el color; cuanto mayor sea la citotoxicidad, más claro será el color.
3. Para las células adherentes, se requieren al menos 1000 células por pozo (100 μL de medio). Para los leucocitos, se requieren al menos 2500 células por pozo (100 μL de medio) debido a su baja sensibilidad. La placa de 96 pozos recomendada tiene un recuento máximo de células de 25,000 por pozo. Si la prueba se realiza utilizando una placa de 24 pozos o de 6 pozos, calcular el número correspondiente de células por pozo y ajustar el volumen de CCK8 al 10% del volumen total del líquido por pozo.
4. Dado que el ensayo CCK8 se basa en la actividad de deshidrogenasa en células vivas, las condiciones o productos químicos que afectan la actividad de deshidrogenasa pueden resultar en una diferencia entre el número real de células viables y el número de células viables medidas utilizando CCK8.
5. El WST-8 puede reaccionar con un agente reductor para formar WST-8 formazán. Si se utiliza un agente reductor (como algunos antioxidantes), interferirá con la prueba. Si hay más agente reductor presente en el sistema a probar, es necesario eliminarlo.
6. Después de 2 horas de incubación, el valor de O.D. de fondo suele ser de 0.1-0.2 unidades.
7. Tener cuidado de no introducir burbujas de aire en los pozos, ya que interferirán con el valor de O.D.
8. Si se desea esterilizar la solución CCK8, utilizar una solución filtrada con membrana de 0.2 μm.
9. El tiempo de incubación variará dependiendo del tipo y la cantidad de células en el pozo. Generalmente, los leucocitos son menos coloreados y pueden requerir tiempos de incubación más largos (hasta 4 horas) o grandes cantidades de células (~10^5 células/pozo).
10. Si hay alta turbidez en la suspensión celular, medir y restar el valor de O.D. de la muestra a 600 nm o más.
11. El CCK8 no se puede utilizar para la tinción de células.
12. El rojo de fenol en el medio no afecta los resultados experimentales. La absorbancia del rojo de fenol se puede eliminar restando la absorbancia del fondo en el pozo en blanco durante el cálculo, por lo que no afectará la detección.
13. La toxicidad del CCK8 es muy baja. Después de completar el ensayo CCK8, las mismas células se pueden utilizar para otros ensayos de proliferación celular, como el ensayo de violeta cristal, el ensayo de rojo neutro o el ensayo de fluorescencia de ADN. (A menos que las células sean extremadamente raras, no se recomienda).
14. Este kit se puede utilizar en E. coli pero no en células de levadura.
15. Antes de leer la placa, se puede mezclar suavemente en el agitador.
16. Se recomienda la inoculación de células en los pozos cercanos al centro de la placa. El medio en el círculo más externo de los pozos se evapora fácilmente y se puede llenar con PBS, agua o medio.
17. Si no se dispone de un filtro de 450 nm. También se pueden utilizar filtros con absorbancia entre 430 y 490 nm, y filtros de 450 nm para una sensibilidad óptima.
18. Medir la absorbancia a 450 nm. Si se necesita realizar una medición de longitud de onda dual, la absorbancia a 650 nm se puede determinar como longitud de onda de referencia.
19. La presencia de iones metálicos en el fármaco puede afectar la sensibilidad del CCK8. El cloruro de plomo, el cloruro de hierro y el sulfato de cobre a una concentración final de 1 mM inhiben el 5%, 15% y 90% de la reacción de color, reduciendo la sensibilidad. Si la concentración final es de 10 mM, será inhibida al 100%.