H2DCFDA (DCFH-DA) (Synonyms: DCFH, DCFHDA) |
| Catalog No.GC30006 |
H2DCFDA (DCFH-DA) es una sonda fluorescente sensible al estado redox, que puede usarse para medir los niveles de especies reactivas de oxígeno intracelular.
Products are for research use only. Not for human use. We do not sell to patients.
Cas No.: 4091-99-0
Sample solution is provided at 25 µL, 10mM.
- Aggregate (2025)：e70034.
- Aging Cell (2024)：e14143.PMID:38482753
- J Med Chem 64.24 (2021)：17979-17991.PMID:34852457
- Biomolecules 13.1 (2023)：102.PMID:36671487
- J Agr Food Chem 69.45 (2021)：13557-13567.PMID:34726896
- Fish Shellfish Immun 127 (2022)：836-842.PMID:35843526
- Ann Hematol 102.10 (2023)：2845-2855.PMID:37500898
- Fish Shellfish Immun (2024)：109852.PMID:39173982
- Tissue Eng Regen Med (2025)：1-11.PMID:39928235
- J Herbs Spices Med P (2025)：1-16.
- Int J Nanomed (2024)：10165-10183.
- Heliyon (2024).
- Plant J (2024).PMID:38308390
H2DCFDA (DCFH-DA) es una sonda fluorescente sensible al estado redox, que puede usarse para medir los niveles de especies reactivas de oxígeno intracelular.[1] El método más popular para medir la formación de ROS celulares es el ensayo de 2',7'-diclorodihidrofluoresceína diacetato (H2DCFDA(DCFH-DA)).
El tinte fluorogénico H2DCFDA(DCFH-DA) se utilizó para detectar la producción de ROS. Usualmente, después de difundirse en la célula, H2DCFDA(DCFH-DA) es desacetilado por las esterasa celulares en un compuesto no fluorescente que posteriormente es oxidado por ROS en 2',7'-diclorofluoresceína (DCF). El experimento in vitro para determinar la capacidad del TBBPA solo para estimular la conversión de H2DCFDA(DCFH-DA) en su producto fluorescente DCF se realizó en un modelo libre de células. Se añadió una dilución de 5 μM de H2DCFDA(DCFH-DA) y concentraciones crecientes de TBBPA (0,1-100 μM) a placas de 96 pocillos que contenían buffer PBS sin Ca2+ y Mg2+ o DMEM/F12 sin suero o DMEM/F12 suplementado con 5 % de FBS en un volumen final de 100 μL. La fluorescencia se midió a los 30 y 60 minutos después de la adición de TBBPA. La versión desacetilada y oxidada de H2DCFDA(DCFH-DA): la fluorescencia de DCF se detectó a 485 y 535 nm de los espectros máximos de excitación y emisión, respectivamente. Este estudio in vitro examinó el impacto de TBBPA en la fluorescencia de H2DCFDA(DCFH-DA) sin células en buffer PBS, DMEM/F12 y DMEM/F12 con 5 % de medios FBS. Los resultados obtenidos mostraron que el TBBPA en todas las concentraciones probadas interactuó con H2DCFDA(DCFH-DA) en buffer PBS y causó un aumento significativo en la fluorescencia. El ensayo H2DCFDA(DCFH-DA) no puede usarse en experimentos de cultivos celulares con TBBPA. Los resultados sugieren que los datos sobre la producción de ROS estimulada por TBBPA en modelos de cultivo celular utilizando el ensayo H2DCFDA(DCFH-DA) deben revisarse utilizando un método diferente.[3]
References:
[1]. Park JH, Moon S-H, Kang DH, et al. Diquafosol sodium inhibits apoptosis and inflammation of corneal epithelial cells via activation of Erk1/2 and RSK: in vitro and in vivo dry eye model. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2018;59:5108–5115. doi.org/ 10.1167/iovs.17-22925.
[2]. Szychowski KA, Rybczyńska-Tkaczyk K, et al. Tetrabromobisphenol A (TBBPA)-stimulated reactive oxygen species (ROS) production in cell-free model using the 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (H2DCFDA) assay-limitations of method. Environ Sci Pollut Res Int. 2016 Jun;23(12):12246-52.
[3]. Gomes A, Fernandes E, at al. Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species. J Biochem Biophys Methods JLFC (2005) 65:45–80
Plan de procedimiento:
1. Preparación de la solución de tinción
(1) Preparar la solución madre: Disolver H2DCFDA (DCFH-DA) en DMSO y preparar una solución madre con una concentración de 1-10 mM.
Nota: La solución madre no utilizada debe ser alicuotada y almacenada en la oscuridad a -20°C o -80°C para evitar ciclos repetidos de congelación y descongelación.
(2) Preparar la solución de trabajo: Diluir la solución madre con un tampón adecuado (como medio libre de suero o PBS) y preparar una solución de trabajo con una concentración de 1-10 μM.
Nota: Ajuste la concentración de la solución de trabajo según las necesidades específicas del experimento y preparela justo antes de su uso.
2. Tinción de células en suspensión
(1) Células en suspensión: Centrifugar a 1000g durante 3-5 minutos a 4°C, desechar el sobrenadante y lavar dos veces con PBS, 5 minutos cada vez.
(2) Células adherentes: Lavar dos veces con PBS, añadir tripsina para digerir las células y centrifugar a 1000g durante 3-5 minutos después de la digestión.
(3) Añadir la solución de trabajo de H2DCFDA (DCFH-DA) para resuspender las células e incubar a 37°C en la oscuridad durante 5-30 minutos. El tiempo de incubación óptimo varía según el tipo de célula, por lo que es necesario explorar según las necesidades específicas del experimento.
(4) Después de la incubación, centrifugar a 1000g durante 5 minutos, desechar el sobrenadante, añadir PBS y lavar 2-3 veces, 5 minutos cada vez.
(5) Incubar las células con medio de cultivo celular libre de suero precalentado o PBS.
3. Tinción de células adherentes
(1) Cultivar las células adherentes sobre cubreobjetos estériles.
(2) Retirar el cubreobjetos del medio de cultivo, aspirar el exceso de medio y colocar el cubreobjetos en un ambiente húmedo.
(3) Añadir 100 μL de la solución de trabajo del tinte desde una esquina del cubreobjetos y agitar suavemente para cubrir uniformemente todas las células con el tinte.
(4) Incubar a 37°C en la oscuridad durante 5-30 minutos. El tiempo de incubación óptimo varía según el tipo de célula, por lo que es necesario explorar según las necesidades específicas del experimento.
(5) Después de la incubación, desechar la solución de trabajo del tinte y lavar el cubreobjetos 2-3 veces con solución de cultivo precalentada.
(6) Incubar las células con medio de cultivo celular libre de suero precalentado o PBS.
4. Detección microscópica: La longitud de onda máxima de excitación/emisión de H2DCFDA (DCFH-DA) es 488/525 nm.
Precauciones:
① Para derivados de diacetato, se requiere un tiempo corto de recuperación para que las esterasas intracelulares los hidrolizen, permitiendo que el tinte responda al estrés oxidativo. El tiempo de recuperación óptimo varía ampliamente, ya que ciertos tipos de células pueden mostrar niveles extremadamente bajos de actividad esterasica;
② Antes de exponer las células a estímulos experimentales, se debe medir la intensidad de fluorescencia de fondo de las células;
③ Para el análisis por citometría de flujo, la dispersión de ángulo frontal y la dispersión de ángulo lateral de las células no deben cambiar antes y después del tratamiento con el tinte; los cambios en el tamaño de las células pueden ser causados por el tratamiento con fármacos o reacciones tóxicas;
④ Se recomienda realizar la detección de fluorescencia en sistemas experimentales que no contengan células. En ausencia de esterases extracelulares y otras oxidasas, el aumento gradual de la fluorescencia con el tiempo puede estar relacionado con factores como la hidrólisis instantánea, la oxidación al aire y la oxidación inducida por la luz;
⑤ En el grupo control (sin medicación), las enzimas intracelulares o los antioxidantes naturales eliminarán los radicales libres de oxígeno. Después del tiempo de recuperación de la carga del tinte, las células sanas deben mostrar una señal de fluorescencia de bajo nivel y ser relativamente estables durante todo el experimento;
⑥ Puede observarse un aumento gradual (debido a la autooxidación) o una disminución (debido a la pérdida de tinte intracelular o fotoextinción) de la señal de fluorescencia;
⑦ En un sistema que no contenga ningún irritante o inductor, si se encuentra una fuerte fluorescencia en células sanas y no tratadas, esto podría indicar muerte celular u otros eventos oxidativos;
⑧ Todos los tintes fluorescentes tienen problemas de extinción. Trate de evitar la luz para ralentizar la extinción de la fluorescencia;
⑨ Para su seguridad y salud, utilice una bata de laboratorio y guantes desechables.
| Cas No. | 4091-99-0 | SDF | |
| Sinónimos | DCFH, DCFHDA | ||
| Canonical SMILES | O=C(O)C1=CC=CC=C1C2C3=C(OC4=C2C=C(Cl)C(OC(C)=O)=C4)C=C(OC(C)=O)C(Cl)=C3 | ||
| Formula | C24H16Cl2O7 | M.Wt | 487.29 |
| Solubility | ≥ 150 mg/mL in DMSO(307.82 mM); 14.29 mg/mL in Ethanol(29.33 mM); < 0.1 mg/mL in Water(insoluble) | Storage | Store at -20°C, protect from light |
| General tips | Please select the appropriate solvent to prepare the stock solution according to the
solubility of the product in different solvents; once the solution is prepared, please store it in
separate packages to avoid product failure caused by repeated freezing and thawing.Storage method
and period of the stock solution: When stored at -80°C, please use it within 6 months; when stored
at -20°C, please use it within 1 month. To increase solubility, heat the tube to 37°C and then oscillate in an ultrasonic bath for some time. |
||
| Shipping Condition | Evaluation sample solution: shipped with blue ice. All other sizes available: with RT, or with Blue Ice upon request. | ||
| Prepare stock solution | |||
|
1 mg | 5 mg | 10 mg |
| 1 mM | 2.0522 mL | 10.2608 mL | 20.5217 mL |
| 5 mM | 0.4104 mL | 2.0522 mL | 4.1043 mL |
| 10 mM | 0.2052 mL | 1.0261 mL | 2.0522 mL |
Step 1: Enter information below (Recommended: An additional animal making an allowance for loss during the experiment)
g
μL
Step 2: Enter the in vivo formulation (This is only the calculator, not formulation. Please contact us first if there is no in vivo formulation at the solubility Section.)
Calculation results:
Working concentration: mg/ml;
Method for preparing DMSO master liquid: mg drug pre-dissolved in μL DMSO ( Master liquid concentration mg/mL, Please contact us first if the concentration exceeds the DMSO solubility of the batch of drug. )
Method for preparing in vivo formulation: Take μL DMSO master liquid, next addμL PEG300, mix and clarify, next addμL Tween 80, mix and clarify, next add μL ddH2O, mix and clarify.
Method for preparing in vivo formulation: Take μL DMSO master liquid, next add μL Corn oil, mix and clarify.
Note: 1. Please make sure the liquid is clear before adding the next solvent.
2. Be sure to add the solvent(s) in order. You must ensure that the solution obtained, in the previous addition, is a clear solution before proceeding to add the next solvent. Physical methods such as vortex, ultrasound or hot water bath can be used to aid dissolving.
3. All of the above co-solvents are available for purchase on the GlpBio website.
Quality Control & SDS
- View current batch:
- Purity: >97.00%
- COA (Certificate Of Analysis)
- SDS (Safety Data Sheet)
- Datasheet
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