Détermination du degré de polymérisation de α-D-1,4-Glucan par la méthode CCVJ
Ce protocole est adapté à partir de données de recherche et fourni à titre de référence uniquement. Des ajustements peuvent être nécessaires en fonction des exigences expérimentales spécifiques.
(1)Préparation des réactifs et des échantillons : Dissoudre CCVJ dans le diméthylsulfoxyde (DMSO) pour préparer une solution de stock de 1 mmol/L, et conserver à l'abri de la lumière. Diluer à la concentration de travail (par exemple, 19µM) en utilisant un tampon phosphate de sodium (5mM, pH = 7,0) avant utilisation. Préparer une série de solutions ou de dispersions de molécules modèles de α-D-1,4-Glucan linéaire (MM) avec différents degrés de polymérisation (DP). La plage de concentration doit être 1,5g/L, couvrant des masses moléculaires de 0,18 KDa à 70,00 kDa (correspondant à DP1 à DP450).
(2)Incubation et centrifugation des échantillons : Placer 1,0-5,0mg de l'échantillon MM dans un tube à centrifuger de 1,5mL. Ajouter 990µL de tampon phosphate de sodium et 10µL de la solution de stock de CCVJ pour obtenir une concentration finale de CCVJ de 19µM. Vortexer pour mélanger complètement, puis incuber à 100°C pendant une heure. Après refroidissement à température ambiante, centrifuger à 8000g pendant 15 minutes. Collecter le surnageant et le laisser reposer à l'abri de la lumière pendant une heure avant utilisation.
(3)Mesure du spectre de fluorescence : Transférer 150µL du surnageant dans une cuve de quartz micro. Utiliser un spectrofluorimètre pour scanner le spectre de fluorescence de CCVJ avec une longueur d'onde d'excitation de 420nm et une plage de longueurs d'onde d'émission de 450-600nm (ou surveiller spécifiquement autour de 491nm). Régler la largeur de la fente à 10nm et la température à 25°C. Enregistrer l'intensité de fluorescence à la longueur d'onde d'émission maximale (environ 491-494nm).
Précautions :
(1)CCVJ est photosensible. Toutes les opérations doivent être réalisées à l'abri de la lumière. Les conditions de température et de pH pendant l'incubation et la mesure doivent être strictement contrôlées.
(2)Pour votre sécurité et votre santé, portez une blouse de laboratoire et des gants jetables pendant l'opération.
References:
[1] Huang M, Guo S, Li Z, et al. Molecular rotor as an in-situ fluorescent probe for the degree of polymerization of α-D-1,4-glucans. Carbohydr Polym. 2024 Jan 15;324:121573. |
