Cy5-DBCO

Méthode de marquage et de traçage cellulaire à Cy5-DBCO^[1]
Ce protocole est adapté de données de recherche, il est fourni uniquement à titre de référence. Des ajustements peuvent être nécessaires selon vos conditions expérimentales spécifiques.
1.Préparation des réactifs : Dissoudre N-azidoacetyl-D-mannosamine tétra-acétaté (Ac4ManNAz) dans un milieu de culture cellulaire complet pour préparer une solution travail à 50µM. Dissoudre Cy5-DBCO dans un tampon adapté (DPBC, pH 7,4) pour préparer une solution travail (20µM pour les expériences in vitro, 25µM pour l'injection in vivo).
2.Marquage des azotures sur les cellules cibles : Ensemencer les cellules cibles à la densité appropriée et les cultiver dans un milieu complet contenant 50µM d' Ac4ManNAz pendant 3 jours, pour introduire des groupes azotures sur l'extérieur cellulaire par voie métabolique.
3.Marquage et détection à Cy5-DBCO (In Vitro): Laver les cellules traitées par Ac4ManNAz deux fois avec DPBS (pH 7,4). Ajouter la solution travail Cy5-DBCO (20µM), incuber à 37°C pendant une heure. Laver soigneusement les cellules avec DPBS pour éliminer la sonde non liée. Ensuite, fixer les cellules (avec un fixateur formaldéhyde-glutaraldéhyde), colorer les noyaux (avec DAPI), réaliser l'imagerie par fluorescence au microscope confocal à balayage laser (Ex=635nm, Em=650-700nm). Une analyse quantitative peut aussi être faite par cytométrie en flux.
4.Marquage et détection à Cy5-DBCO (In vivo) : Injecter directement les cellules cibles traitées par Ac4ManNAz pendant 3 jours dans l'organe cible d'un animal vivant. Trois jours après la transplantation cellulaire, injecter la solution de Cy5-DBCO (25μM, 200μL) dans la veine caudale de rat. Quatre heures après l'injection de la sonde, utiliser un système d'imagerie in vivo pour l'imagerie par fluorescence du corps entier, afin d'observer les signaux spécifiques au niveau de l'organe cible. Alternativement, disséquer l'organe pour une imagerie ex vivo sur un poste d'imagerie par fluorescence, ou préparer les coupes congelées pour l'observation microscopique.
Précautions : 
(1)Cy5-DBCO libre et non-réagi est principalement éliminé par voie rénale dans les 4 heures suivant l'injection, ce qui aide à réduire le signal de fond.
(2)Pour votre sécurité et votre santé, portez une blouse de laboratoire et des gants jetables toute l'opération.

References:
[1] Kang SW, Lee S, Na JH, et al. Cell labeling and tracking method without distorted signals by phagocytosis of macrophages. Theranostics. 2014 Feb 12;4(4):420-31.