Evaluation de teneur en calcium à l'aide de Mag-Fura-2 AM[1]
Ce protocole est juste un guide, il faut l'adapter à vos besoins spécifiques.
1.Préparer la solution de colorant
(1)Solution stock : Préparez une solution stock de Mag-Fura-2 AM à 1-10mM avec DMSO anhydre de haute qualité. Astuce : Aliquotez la solution stock inutilisée, stockez-la à -20°C ou -80°C à l'abri de la lumière, pour éviter les congélations/décongélation répétées.
(2)Solution de travail : Diluez la solution stock avec un tampon adapté (comme du milieu de culture sans sérum ni phénol rouge, ou PBS) pour obtenir une solution à 1-10µM. Ajustez la concentration selon la situation réelle, et préparez-la juste avant utilisation pour éviter les congélations/décongélations répétées. Attention : la solution de travail doit être fraîche, préparée le jour de l'expérience. Avant de l'utiliser, la solution de Mag-Fura-2 AM doit être réchauffée et centrifugée.
2.Coloration des suspensions cellulaires
(1)Cellules en suspension : Centrifugez à 4°C, 1000g pendant 3-5 minutes, jetez le surnageant, lavez 2 fois avec PBS ou un autre tampon (5 minutes chaque fois).
(2)Cellules adhérentes : Lavez 2 fois avec PBS ou un autre tampon, ajoutez de la trypsine pour digérer les cellules, centrifugez à 1000g pendant 3-5 minutes après digestion.
(3)Incubez les cellules à la température requise (25°C-37°C) pendant 10 minutes pour que le gradient ionique se stabilise. Préparez la solution de sonde : dans 1mL de milieu de culture des cellules, ajoutez 4µL de solution stock de Mag-Fura-2 AM et 5µL de 20% Pluronic® F-127, vortexez vigoureusement pour avoir une dispersion homogène. Ajoutez 250µL de cette solution de sonde à 750µL de milieu contenant les cellules, mélangez bien. A ce stade, la concentration finale de la solution de travail est de 1-5µM (selon la solution stock initiale). Incubez la sonde 15-60 minutes selon les besoins, lavez les cellules 3 fois, puis ré-incubez 30 minutes pour que la sonde soit complètement désestérifiée dans les cellules.
Remarques
1). La concentration de travail recommandée de Mag-Fura-2 AM dans la plupart des cellules, c'est 1-5µM, et il faut ajuster la concentration exacte selon les besoins de l'expérience. Pour éviter la cytotoxicité liée à une surcharge, utilise la plus faible concentration de sonde possible tout en gardant les résultats efficaces.
2). (Optionnel) Si les cellules ont des transporteurs d'anions organiques, tu devras peut-être ajouter du prébenécide (1-2,5mM) ou de la sulfinpyrazone (0,1-0,25mM) dans le milieu de culture, pour réduire la fuite de la sonde désestérifiée. La solution stock de probénécide ou de sulfinpyrazone est alcaline, donc il faut réajuster pH après l'ajout dans le milieu.
3). Si tu utilises un milieu avec sérum, la lactonase du sérum va dégrader Mag-Fura-2 AM, ce qui réduit l'efficacité du marquage; et un milieu avec rouge de phénol va augmenter un peu le bruit de fond. Pense à laver les cellules 2 à 3 fois avant d'ajouter la solution de travail de coloration.
4). Baisser la température de marquage peut réduire la compartimentation de la sonde.
(4) Choisis l'appareil adapté et fais la mesure de fluorescence (Ex/Em=336/503nm).
3. Coloration de cellules adhérentes
(1)Cultive les cellules adhérentes sur les lamelles stériles.
(2)Retire la lamelle du milieu de culture, aspire l'excès de milieu, et place-la dans un environnement humide.
(3)Incube les cellules à la température voulue (25°C-37°C) pendant 10 minutes pour que le gradient ionique se stabilise. Prépare la solution de sonde : dans 1mL de milieu de culture des cellules, ajoute 4µL de solution stock de Mag-Fura-2 AM et 5µL de 20% Pluronic® F-127, vortexe fort pour avoir une dispersion homogène. Prends 250µl de cette solution et ajoute-la à 750µL de milieu avec les cellules, mélange bien. A ce stade, la concentration finale de la solution de travail est de 1-5µM (selon la concentration de la solution stock initiale). Incube la sonde 15-60 minutes selon les besoins, lave les cellules 3 fois, puis ré-incube 30 minutes pour être sûr que la sonde est complètement désestérifiée dans les cellules.
(4)Choisis l'appareil adapté et fais la mesure de fluorescence (Ex/Em=336/503nm).
4. Précautions :
(1)Tous les colorants fluorescents ont un problème de Quenching (extinction de fluorescence). Donc évite la lumière a maximum pour ralentir ce phénomène.
(2)Pour ta sécurité et ta santé, pense à mettre ta blouse de labo et des gants jetables pendant toute la manipulation.
(3)Mag-Fura-2 AM doit être conservé à l'abri de la lumière pendant toute l'expérience.
(4)Ce protocole et tous les réactifs sont réservés à la recherche scientifique uniquement.
References:
[1] Gurney A M, Drummond R M, Fay F S. Calcium signalling in sarcoplasmic reticulum, cytoplasm and mitochondria during activation of rabbit aorta myocytes[J]. Cell Calcium, 2000, 27(6): 339-351. |
