1.Aperçu
Pour la quantification de RNA de RiboGreen, deux concentrations différentes de colorant sont nécessaires pour obtenir une plage cinétique linéaire complète. Avant de préparer la solution de travail RiboGreen (voir la préparation des réactifs ci-dessous), il est nécessaire de décider s'il faut effectuer un dosage à haute plage (RNA de 20ng/mL - 500ng/mL), un dosage à basse plage (RNA de 1ng/mL - 50ng/mL), ou les deux plages.
2.Préparations des réactifs
Le jour de l'expérience, la solution de travail hydrosoluble de RiboGreen est préparée dans un tube en plastique de polypropylène jetable stérile. Evitez d'utiliser des récipients en verre car RiboGreen peut adhérer aux surfaces de verre. La solution de travail RiboGreen préparée doit être conservée à l'abri de la lumière. Il est préférable d'utiliser la solution de travail dans les quelques heures suivant sa préparation et de ne pas la conserver pour une utilisation à long-terme.
3.Préparation de la courbe standard de RNA.
Pour la courbe standard; des standards de RNA commerciaux peuvent être utilisés, comme RNA ribosomaux 16S et 23S communément utilisés; ou d'autres produits de RNA purifiés. Parfois, il est recommandé d'utiliser des standards de RNA similaires à l'échantillon à tester pour établir une courbe standard. Généralement parlant, la grande majorité des molécules de RNA à simple brin peuvent produire des signaux de fluorescence presque équivalents. En présence de composés communs qui contaminent les réactifs d'acide nucléique comme les nucléosides, les sels, l'urée, l'éthanol, le chloroforme, les détergents, les protéines et l'agarose, les résultats de détection de RiboGreen peuvent toujours maintenir une bonne relation linéaire, même si l'intensité de fluorescence peut être affectée. Afin de garantir un contrôle effectif, la solution de RNA utilisée pour préparer la courbe standard doit être cohérente avec l'échantillon à tester, ce qui peut garantir la présence de composés indésirables au niveau similaire.
3.1 Préparer une solution de RNA à 2µg/mL dans une bouteille en plastique en utilisant un tampon 1XTE. Mesurer l'absorbance de base de la solution de RNA à 260nm (A260) en utilisant une cuvette colorimétrique dans un chemin de 1cm de longueur. A260 = 0,05 équivaut à la concentration de RNA A de 2µg/mL.
3.2 Lors de la préparation de courbe standard à haute portée
Préparez une série de solutions standard de RNA à 2x la concentration finale au moyen de diluer une solution de RNA à 2µg/mL dans un tube en plastique jetable exempt de nucléases. Transférer enfin le mélange dans une cuvette colorimétrique ou une plaque de culture.
3.3 Lors de la préparation de la courbe standard à basse portée
Préparez une série de solutions standard de RNA à 2x la concentration finale au moyen de diluer une solution de RNA à 2µg/mL dans un tube en plastique jetable exempt de nucléases. Transférer enfin le mélange dans une cuvette colorimétrique ou une plaque de culture.
3.4 Mélangez des volumes égaux de la solution de travail du réactif RiboGreen (voir 2 - préparation des réactifs) et de la solution standard de RNA à 2x la concentration. Incubez à la température ambiante, en obscurité, pendant 2 à 5 minutes, en veillant à ajouter un volume suffisant de solution de mesure dans le contenant de mesure. Pour une cuvette colorimétrique de 10 X 10 mm, le volume ne doit pas être inférieur à 2 mL; pour chaque puits d'une plaque à 96 puits, le volume ne doit pas être inférieur à 200µL.
3.5 Utiliser un spectrophotomètre de fluorescence ou un lecteur d'ELISA (immuno-analyse enzymatique liée) à fluorescence pour mesurer la valeur de fluorescence de l'échantillon. Sélectionnez la longueur d'onde de fluorescence standard (excitation ~480nm, émission~520nm).
3.6 Soustrayer la valeur de fluorescence du blanc de la valeur de fluorescence de chaque échantillon. Ensuite, utiliser les valeurs de fluorescence calibrées en tant qu'axe des y et la concentrations de RNA en tant qu'axe des x pour établir une courbe standard.
4. Analyse de l'échantillon
4.1 Diluez l'échantillon avec un tampon 1 x TE à un volume approprié (par exemple, 1,0 mL pour une cuvete de 10 x 10 mm ou 100µL pour une microplaque à 96 puits). Il est recommandé d'utiliser plusieurs facteurs de dilution pour chaque échantillon à tester. Plus le facteur de dilution de l'échantillon testé est élevé, puis il est utile pour réduire l'interférence des polluants spécifiques. Cependant, éviter des volumes d'échantillon trop petits, car ils sont difficiles à mesurer avec précision. D'ailleur, dans la même expérience, tenez le niveau d'impuretés aussi constants que possible pour réduire les différences de signal entre les échantillons caussées par les impuretés. Par exemple, si une série d'échantillons de RNA ont des concentrations de sel significativement différentes, elles ne peuvent pas être comparées à l'aide d'une simple courbe standard. Pour éviter de tels problèmes, si possible, ajustez la concentration des impuretés dans tous les échantillons au même niveau (Voir 5 - Elimination de DNA dans l'échantillon)
4.2 Ajouter un volume égal de réactif de mesure RiboGreen (voir 2-préparation des réactifs) à chaque échantillon et incuber à la température ambiante, en obscurité, pendant 2 à 5 minutes.
4.3 Sélectionner les mêmes paramètres d'instrument que ceux utilisés pour la mesure de la courbe standard pour déterminer la valeur de fluorescence de l'échantillon. Afin de réduire l'effet de photoblanchiment, le temps de mesure de la fluorescence de tous les échantillons reste inchangé.
4.4 Soustrayer la valeur de fluorescence du blanc de la valeur de fluorescence de chaque échantillon. Déterminer la concentration de RNA de l'échantillon sur la base de la courbe standard de RNA générée. Si possible, vérifier les résultats quantitatifs en diluant différents échantillons et en répétant les mesures.
5.Elimination de DNA dans l'échantillon RiboGreen peut également se lier à DNA. RNA sans DNases peuvent être utilisés pour éliminer DNA de l'échantillon en premier lieu, évitant ainsi l'interférence de fluorescence causée par la liaison de DNA et de RiboGreen et assurant que toute la fluorescence dans l'échantillon provient de la liaison de RiboGreen et de RNA.
5.1 Préparer un tampon de digestion 10xDNase : 200mM Tris HCl sans nucléase, pH 7.5,100 mM MgCl2; 20 mM CaCl2.
5.2 ajouter un volume égal à 0,11 fois le volume du tampon de digestion 10x DNase à chaque échantillon contenant DNA. (Par exemple, si l'échantillon est 9mL, ajouter 1mL tampon 10x).
5.3 Diluez approximativement 5 unités de DNase sans RNase pour 1 μg DNA.
5.4 Incuber à 37°C pendant 90 minutes.
5.5 Diluez l'échantillon au moins 10 fois avec un tampon 1xTE pour réduire l'interférence des ions de sel résiduels dans la solution de digestion sur les mesures RiboGreen.
5.6 Effectuer l'expérience de dosage RiboGreen selon les étapes ci-dessus.
