Biotin-tyramide

電子顕微鏡免疫細胞化学におけるBiotin-tyramideの使用方法^[1]

この実験プロトコールは研究の内容により作成されたものであり、参考までです。ご自分の実際のニーズに合わせてご調整願います。

（1）試薬と抗体の用意：1%のグルタルアルデヒド固定液を0.1Mのリン酸緩衝液で調製（4°Cで保存）；1%の卵白アルブミン遮断溶液を 10mMのPBS（pH=7.2）で調製；標的タンパク質の一次抗体；対応する二次抗体；PBSで1:500に希釈したストレプトアビジン-HRP；1×増幅希釈剤で1:50に希釈したBiotin-tyramide、使用の直前に速やかに調製し、希釈溶液は2週間以上保存してはならない。

（2）組織の処理と包埋：4℃、0.1Mのリン酸緩衝液の中の1%のグルタルアルデヒドに組織片を2時間浸漬し、リン酸緩衝液で洗浄し、その後は、標準手続きに従い、低温でLowicrylに包埋した。

（3）切片の作製とグリッドの取り付け：極薄切片に切断し、使用の為に、カーボンコーティングのニッケルグリッドに取り付ける。

（4）免疫標識とBiotin-tyramide沈着：室温で、1%の卵白アルブミン（PBSに、pH=7.2）の上で、裏向きに浮かべた；対応する一次抗体に室温で2時間、または4℃で一晩転移した；PBSで15分間すすぎ、1%の卵白アルブミンで15分間すすぎ、室温で、対応するビオチン化二次抗体に60分間転移した；PBSで15分間すすぎ、1%の卵白アルブミンで15分間すすぎ、室温で、ストレプトアビジン-HRP 1:500に30分間転移した；PBSで15分間すすぎ、室温で、Biotin-tyramide 1:50（1×増幅希釈剤に）に10分間転移した；PBSと蒸留水ですすいだ後、酢酸ウラニルで染色し、電子顕微鏡で観察した。

注意事項：

（1）1%の卵白アルブミン遮断ステップは、Biotin-tyramideインキュベーションの前に行ってはいけない。さもなければ、HRP-tyramide反応は干渉されてしまう。

（2）Biotin-tyramide希釈液は新鮮に調製するべきである；2週間以上保存した場合、標識の強度が低下してしまう。

（3）ご自分の安全と健康の為に、白衣と使い捨ての手袋を着用し、ドラフトチャンバーでグルタルアルデヒドと酢酸ウラニルを取り扱って下さい。