DBCO-NHS ester

このプロトコールは、アジド染料とDBCO-NHSエステル修飾のタンパク質の無銅クリック反応について説明する。実際の応用条件は、研究の設計に応じて最適化する必要がある^[1-2]。

1.試薬と材料の準備

DBCO-NHS ester、標的のタンパク質、アジド修飾の蛍光染料、PBS、炭酸緩衝液。

2.実験ステップ

（1）タンパク質のDBCO修飾

標的のタンパク質をpH 8.5の炭酸緩衝液に溶解し、濃度は≥ 1mg/mLである。DBCO-NHS esterを無水DMSOに溶解し（標識溶液におけるDMSOの最終濃度を≤ 10%にコントロールする）、5-20:1のDBCO:タンパク質比でタンパク質溶液に添加した。ボルテックスして混合させ、暗所で室温で2時間（または4℃で一晩中）培養した。事前冷却のPBS (pH 7.4)で脱塩カラムを平衡化し、コラムに反応溶液をロードし、遠心分離で精製タンパク質を採取した。タンパク質の濃度を測定し、小分けし、-80℃で冷凍した。

（2）DBCOアジドクリック反応

アジド染料（Azide-Cy5など）をDMSOで1-10mMの貯蔵液に調製し、暗所に保存する。PBS (pH 7.4)で、DBCO:Azide = 1:1.5-3（モル比）の比率で、DBCO修飾のタンパク質とアジド染料を混合させる。ボルテックスして混合させ、暗所で室温で1-4時間反応する（または4℃で一晩中）。脱塩カラムまたは透析液（PBS、4℃、暗所で）で遊離の染料を除去する。SDS-PAGE (蛍光スキャンニング)またはUV-可視化分光法(染料/タンパク質、DOLを計算)を行う。

注意事項

（1）無水の操作：DBCO-NHS esterは加水分解しやすく、乾燥した環境で溶解する必要がある（窒素でパージされたDMSOに溶解）。

（2）モル比の最適化：高いDBCO比はタンパク質の凝集を起こす可能性があり、まずは5:1, 10:1, 15:1のグラジエントでテストすることを推奨する。

（3）光からの保護、低温：DBCOと蛍光染料は両方とも光に敏感なので、プロセスは光から避けて行うべき；4℃で精製を行った。

（4）干渉を避ける：チオール（DTT、β-mercaptoethanolなど）またはアジドを含有する緩衝液で、反応系の汚染を避ける。

（5）細胞実験の検証：生細胞の標識に使われた場合は、修飾タンパク質の生物活性とアジド染料の細胞通過性を検証する必要がある。

References:
[1]. Ciferri MC, Bruno S, Rosenwasser N, et al. Standardized method to Functionalize plasma-extracellular vesicles via copper-free click Chemistry for targeted drug delivery strategies. ACS Applied Bio Materials. 2024 Jan 16; 7(2): 827-838.
[2]. Lee HJ, Fernandes-Cunha GM, Putra I, et al. Tethering growth factors to collagen surfaces using copper-free click chemistry: surface characterization and in vitro biological response. ACS applied materials & interfaces. 2017 Jul 19; 9(28): 23389-23399.