Glu-urea-Lys

このプロトコールはあくまでも参考用である。実際の応用は、ご自分の特定の実験ニーズに合わせて最適化する必要がある。

Glu-urea-Lysリガンド共役脂質ナノ粒子/siRNAシステムの調製^[1-2]：

1.試薬の調製：DSPE-PEG2000-NH₂、N-hydroxysuccinimide (NHS)、1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC)、ホウ酸塩（0.1M、pH 8.5）、透析バッグ(MWCO 3.5kDa)、siRNA、クエン酸緩衝液(10mM, pH 4.0)。

2.Glu-urea-Lys-DSPE-PEG2000複合体の調製

2.1 Carboxylの活性化：DMFにGlu-urea-Lys (1eq)、NHS (2eq)とEDC (2eq)を溶解し、室温で4時間攪拌した。

2.2 DSPE-PEG2000の共役：pH 8.5のホウ酸緩衝液で、活性化された製品をDSPE-PEG2000-NH₂ (1.2eq)に滴下し、暗所、室温で24時間反応した。

2.3 精製：反応混合物を透析バッグに置き、密封し、PBS緩衝液（4℃、暗所、48時間）で浸潤し、小分子不純物を除去し、冷凍乾燥の後、複合体を獲得した。

2.4 検証：MALDI-TOF MSを使い、化合物の分子量を検証した（予想の分子量：DSPE-PEG2000 + Glu-urea-Lys ≈ 2800Da + 348Da）。

3.脂質ナノ粒子（LNP）の調製とsiRNAローディング

3.1 脂質溶液の調製：DLin-MC3-DMA (50%)、コレステロール(38.5%)、DSPC (10%)とGlu-urea-Lys-DSPE-PEG (1.5%)の比率に応じて、各脂質をエタノールに溶解し（総脂質濃度は10mg/mL）、完全に溶解するまで60℃の水浴で超音波処理した。

3.2 水溶相の調製：siRNAをクエン酸緩衝液(0.2mg/mL)に溶解した。

3.3 マイクロ流体混合：脂質相と水相を、3：1の流量比（総流量12mL/分）で、出口はPBS（pH 7.4）で回収した。

3.4 透析浄化：反応混合液を透析バッグに置き、密封し、PBS緩衝液（4℃、光から保護、48時間）で浸潤し、期間中に緩衝液を3回交換した。

4.品質の管理

4.1粒子のサイズ：DLS検出(80-100nm, PDI < 0.2)。

4.2カプセル化効率:RiboGreen法(> 95%)。

4.3siRNAの完全性：アガロースゲル電気泳動（遊離siRNAバンドなし）。

注意事項

1.無菌操作：体内実験には、濾過殺菌（0.22μmのフィルター膜）が必要である。

2.siRNAの安定性：繰り返した冷凍と解凍を避けるため、調製後、LNPsを-80℃で保存しなければならない。

3.体内分布：生物発光イメージング（例えばDiR標識のLNPs）は、標的化の観察のために使用することが可能である。

References:
[1]. Lee J B, Zhang K, Tam Y Y C, et al. A Glu-urea-Lys ligand-conjugated lipid nanoparticle/siRNA system inhibits androgen receptor expression in vivo[J]. Molecular Therapy Nucleic Acids, 2016, 5.
[2]. Zhou W, Huang J, Xiao Q, et al. Glu-Urea-Lys Scaffold Functionalized Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles Targeting PSMA for In Vivo Molecular MRI of Prostate Cancer[J]. Pharmaceutics, 2022, 14(10): 2051.