このプロトコールは実験のガイダンスのみを提供する。実際の応用はご自分の研究対照、サンプル種類と検出プラットフォームに合わせて最適化し、調節する必要があります[1-2]。
1.試薬と材料の準備
Nitrocefin、DMSO、PBS、細菌コロニー、細菌懸濁液または溶解細胞サンプル、加水分解緩衝液
2.Nitrocefin溶液の調製
（1）貯蔵液（1–10mg/mL）：DMSOで5–10mg Nitrocefinを溶解し、よく混ぜて、暗所で保存し、-20℃で数ヶ月間保存する。
（2）作業溶液（0.5–1.0mg/mL）：PBSまたはアッセイ緩衝液で貯蔵液を0.5–1.0mg/mLに希釈する。調製後、溶液が赤色（黄色ではなく）になれば、濃度が高すぎて、更に黄色い溶液に希釈するべきだということを意味する。作業溶液は光から遠ざけて、-20℃で保存し、14日または2か月以内に使うべきである。
3.β-ラクタマーゼ活性の速やかな検出法
（1）スライドテスト：一滴の作業溶液を清潔なスライドに添加し、一つのコロニーを接種し、赤色の出現を観察する（20-30分以内）。
（2）直接接触法：コロニーに作業溶液を滴下し、20-30分以内に赤色に変わるのを観察する。
（3）細菌溶液法：3-5滴の作業溶液を1mLの細菌溶液に添加する。20-30分以内に赤色に変わるのであれば、陽性結果を示唆する。
（4）細胞溶解法：1mLの細菌溶液を超音波溶解し、3-5滴の作業溶液を添加する。40分以内に赤色に変われば、β-ラクタマーゼ活性を示唆する。
4.光度定量検出
（1）標準溶液と反応システム：Nitrocefinと加水分解緩衝液+DMSOで、標準溶液と標準勾配を調製する。
（2）サンプルの処理：固体株の遠心分離、再懸濁と超音波溶解の後、上清をアッセイのために採取した。反応混合物：サンプル+反応混合液（例：アッセイ緩衝液+Nitrocefin）を各ウェルに添加した。
（3）読み取りと算出：490nmで運動学的読み取りを行った。30-60分間、一分ごとに読み取ることを推奨する。標準曲線と時間の変化に基づき、β-ラクタマーゼの活性を算出した。
（4）単位を、1分間あたり1µmol Nitrocefinを加水分解する酵素量と定義する。
操作の注意事項
（1）操作の間に、光を避けて、よって薬物の劣化を阻止する。
（2）黄色い処方の精度を維持するために、作業液が赤色になるまでは使用しないでください。
（3）実験の条件を、各サンプル種の勾配濃度と時間で最適化するべきである。
References:
[1]. Shannon K, Phillips I. ?-Lactamase detection by three simple methods: Intralactam, nitrocefin and acidimetric[J]. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 1980, 6(5): 617-621.
[2]. Allen C, Turner C, Kalsi S, et al. Development of a rapid phenotypic test on a microfluidic device for carbapenemase detection using the chromogenic compound nitrocefin[J]. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, 2020, 96(4): 114926. |
