RiboGreen RNA Reagent

1.概述

RiboGreenのRNA定量検出では、完全な線形運動範囲を獲得するためには、二つの異なる染料濃度を使う必要がある。RiboGreen作業溶液（下記の試薬調製を参照）を調製する前は、高範囲アッセイ(20ng/mL-500ng/mL RNA)か、低範囲(1ng/mL-50ng/mL RNA)か、または両方とも測定するか、決める必要がある。

2.試薬の調製

実験当日、無菌の使い捨てポリプロピレンプラスチックチューブでRiboGreenの水溶性作業溶液を調製した。ガラスの表面にRiboGreenが付着する可能性があるため、ガラス製品の使用を避けるべき。調製されたRiboGreen作業溶液は、光から避けて保存するべきである。できれば、調製の数時間内で作業液を使い果し、長期の使用のために保存することを勧めない。

3.RNA標準曲線の準備

標準曲線については、商業化RNA標準は使用可能であり、例えばよく使われる16Sと23SリボソームRNAである；またはその他の精製RNA製品である。時に、標準曲線を建てるには、テストされたサンプルに似ているRNA標準を推奨する。総じて言えば、殆どの一本鎖RNA分子は、ほぼ同じレベルの蛍光シグナルを製造できる。

ヌクレオシド、塩、尿素、エタノール、クロロホルム、洗剤、タンパク質とアガロースなどの核酸試薬を汚染するよくある化合物の存在下で、RiboGreenの検出結果は、蛍光の強度が影響されるかもしれないが、優れた線形関係を維持できる。効果的な対照を確保するため、標準曲線の準備に使われたRNA溶液は、これから測定されるサンプルと一致する必要があり、よって似たようなレベルの不純物化合物の存在を確保できる。

3.1プラスティックボトルで、1xTE緩衝液で2 μ g/mL RNA溶液を調製する。比色カップを使い、長さ1cmの経路で、260nm (A260)でのRNA溶液の基本吸光度を測定する。A260=0.05は2μ g/mLのRNA Aの濃度に等しい。

3.2高範囲標準曲線を準備する時、2 μ g/mLのRNA溶液を使い捨ての無ヌクレアーゼのプラスティック管に希釈することで、一連の2xの最終濃度のRNA標準溶液を調製し、最後に比色皿または培養プレートに移す。

3.3低範囲標準曲線を準備する時、2 μ g/mLのRNA溶液を使い捨ての無ヌクレアーゼのプラスティック管に希釈することで、一連の2xの最終濃度のRNA標準溶液を調製し、最後に比色皿または培養プレートに移す。

3.4等量のRiboGreen試薬作業溶液（2-試薬の調製を参照）と2xRNAの標準溶液を混合させる。暗所で室温で2-5分間培養し、十分な量の測定溶液が測定容器に添加されたのを確保する。10x10mmの比色皿については、2mLより少なくてはいけない；96ウェルのプレートの各ウェルについて、200μLより下げてはならない。

3.5蛍光分光光度計または蛍光酵素連結の免疫吸着剤アッセイ(ELISA)リーダーを選び、サンプルの蛍光値を測定し、標準蛍光波長（励起~480nm、発光~520nm）を選ぶ。

3.6各サンプルの蛍光値から空白の蛍光値を抽出する。その後、測定された蛍光値を縦軸に、RNA濃度を横軸に、標準曲線を建てる。

4.サンプルの分析

4.1サンプルを1xTE緩衝液で、適切な量（例えば、10x10 mmのキュベットには1.0mLで、96ウェルのマイクロプレートには100μL）まで希釈する。測定される各サンプルには、一つ以上の希釈因子を行うことを推奨する。測定サンプルの希釈因子が高ければ高いほど、特定の汚染物質の干渉を減少するのに役立つ。しかし、正確に測定することが難しいため、特定の小サンプル量を避ける必要もある。

更に、同じ実験で、不純物のレベルは、できる限り一致にする必要があり、よって不純物によるサンプル間のシグナル差を減らす。例えば、一連のRNAサンプルの塩の濃度が明らかに異なれば、簡単な標準曲線では比較できなくなる。このような問題を避けるには、可能であれば、全てのサンプルで不純物濃度を同じレベルに調整する。（5-サンプルにおけるDNAのクリアランスを参照）

4.2各サンプルに等量のRiboGreen測定試薬（2-試薬の調製を参照）を添加し、暗所で室温で2-5分間培養する。

4.3標準曲線測定時と同様の機器パラメーターを選び、サンプルの蛍光値を測定する。光退色効果を減らすため、全てのサンプルの蛍光測定時間は変わらないまま維持するべき。

4.4各サンプルの蛍光値から空白の蛍光値を抽出する。生成されたRNA標準曲線に基づき、サンプルのRNA濃度を決める。可能であれば、異なるサンプルを希釈し、測定を繰り返すことで、定量の結果を検証する。

5.サンプルにおけるDNAクリアランス

RiboGreenもDNAと結合でき、まずは無RNAのDNaseでサンプルからDNAを除去し、よってDNAとRiboGreenの結合による蛍光干渉を避け、サンプルにおける全ての蛍光が、RiboGreenとRNAの結合から来ることを確保する。

5.110x DNase消化緩衝液の調製：ヌクレアーゼなしの200mM Tris HCl、pH 7.5、100 mM MgCl2、20 mM CaCl2。

5.2サンプルを含む各DNAに、0.11倍の体積の10xDNase消化緩衝液を添加する。（例えば、サンプルが9mLであれば、1mLの10x緩衝液を添加する）

5.3　1 μ gのDNAに、~5単位のRNaseのないDNaseを添加する。

5.4　37℃で、90分間培養する。

5.5　1xTE緩衝液で、サンプルを少なくとも希釈し、RiboGreenに対する消化液の残留塩イオンの干渉を減らす。

5.6上記のステップに応じて、RiboGreenアッセイ実験を行う。