CCVJ

Determinación del grado de polimerización del α-D-1,4-Glucan por el método CCVJ 

Este protocolo está adaptado a partir de datos de investigación y se proporciona solo como referencia. Los ajustes pueden ser necesariso en función de requisitos experimentales específicos.

(1) Preparación de reactivos y muestras: Disuelva CCVJ en dimetil sulfóxido (DMSO) para preparar una solución de stock de 1mmol/L, y almacene protegido de la luz. Diluir a la concentración de trabajo (e.g., 19µM) usando tampón de fosfato de sodio (5mM, pH=7.0) antes de usar. Prepare una serie de soluciones o dispersiones de moléculas modelo lineales de α-D-1,4-glucan (MM) con diferentes grados de polimerización (DP). El rango de concentración debe ser de 1-5g/L, cubriendo pesos moleculares de 0.18kDa a 70.00kDa (correspondientes a DP1 a DP450).

(2) Incubación y centrifugación de muestras: Coloque 1.0-5.0mg de la muestra MM en un tubo centrífugo de 1.5mL. Agregue 990µL de tampón de fosfato de sodio y 10µL de la solución de stock de CCVJ para lograr una concentración final de CCVJ de19µM. Vórtice para mezclar bien, luego incubar a 100°C durante 1 hora. Después de enfriar a temperatura ambiente, centrifugar a 8000g durante 15 minutos. Recoge el sobrenadante y déjalo protegido de la luz durante 1 hora antes de usarlo.

(3) Medición del espectro de fluorescencia: Transfiera 150µL del sobrenadante a una cubeta de micro cuarzo. Utilice un espectrofotómetro de fluorescencia para escanear el espectro de fluorescencia CCVJ con una longitud de onda de excitación de 420nm y un rango de longitud de onda de emisión de 450-600nm (o monitor específicamente alrededor de 491nm). Ajuste el ancho de la hendidura a 10 nm y la temperatura a 25°C. Registre la intensidad de fluorescencia en la longitud de onda máxima de emisión (approximadamente 491-494nm).

Precauciones:

(1) CCVJ es sensible a la luz. Todas las operaciones deben realizarse con protección contra la luz. Las condiciones de temperatura y pH durante la incubación y medición deben controlarse estrictamente. 

(2) Por su seguridad y salud, por favor use una bata de laboratorio y guantes desechables durante la operación.