Lucigenin (NSC-151912)

Protoloco para medir el estrés oxidativo en células vivas usando lucigenina 

Este protocolo está adaptado a partir de datos de investigación y se proporciona solo como referencia. Los ajustes pueden ser necesarios en función de requisitos experimentales específicos. 

1. Preparación de la solución de tinción

(1) Preparación de la solución de stock: Disolver la Lucigenin en DMSO para preparar una solución de stock de 10mM.

Nota: Aliquote y almacene la solución de stock no utilizada a -20°C o -80°C, protegida de la luz. Evite los ciclos repetidos de congelación y descongelación. 

(2) Preparación de la solución de trabajo: Diluir la solución de stock con un tampón apropiado (e.g., medio de cultivo celular sin suero o PBS) para preparar una solcuión de trabajo de 5-10µM.

Nota: Adjuste la concentración de trabajo según sea necesario. Se recomienda preparar la solución de trabajo fresca antes de su uso.

2. Tinción de células de suspensión

(1) Células de suspensión: Centrifuga a 1000g durante 3-5 minutos a 4°C. Deseche el sobrenadante y lávelo dos veces con PBS, 5 minutos cada vez.

(2) Células adherentes: Deseche el medio de cultivo. Agregue tripsina para separar las células y obtener una suspensión unicelular. Centrifuga a 1000g durante 3-5 minutos a 4°C. Deseche el sobrenadante y lávelo dos veces con PBS, 5 minutos cada vez.

(3) Vueleva a suspender las células en 1mL de solución de trabajo de Lucigenin. Incubar a temperatura ambiente, protegido de la luz, durante 15 minutos.  

(4)Después de la incubación, centrifugar a 400g durante 3-4 minutos a 4°C. Deseche el sobrenadante.

(5) Lave las células dos veces con PBS, 5 minutos cada vez.

(6) Resuspensar las células en medio de cultivo celular libre de suero o PBS. Analizar usando microscopía de fluorescencia o citometría de flujo. Las longitudes de onda máximas de excitación/emisión de fluorescencia son Ex/Em=455/505nm.

3.Tinción de células adherentes

(1) Cultive células adherentes en cubiertas estériles.

(2) Retire el emdio de cultivo y enjuague suavemente las células una vez con PBS precalentado.

(3) Agregue una cantidad adecuada de solución de trabajo de Lucigenin para cubrir todas las células.

(4) Incubar a temperatura ambiente, protegido de la luz, durante 15 minutos.

(5) Después de la incubación, aspire la solución de trabajo de tinte. Lave la hoja de la cubierta 2-3 veces con PBS precalentado.

(6) Se puede añadir una pequeña cantidad de medio fresco sin suero o PBS para cubrir las células para la detección inmediata.

(7) Detección de microscopía: La Lucigenin detecta señales de quimioluminiscencia de aniones de superóxido, con longitudes de onda máximas de excitación/emisión de fluorescencia de Ex/Em=455/505nm.

Precauiones:

(1) Como sonda quimioluminiscente, la intensidad de la señal de la Lucigenin está relacionada con la tasa de producción y la concentración de aniones superóxido. El experimento requiere controles negativos y positivos estrictos.

(2) Los pasos de incubación y detección deben realizarse en la oscuridad para minimizar el posible enfriamiento de fluorescencia y reducir la señal de fondo.