Mag-Fura-2 AM

Evaluación del contenido de calcio usando Mag-Fura-2 AM^[1]

Este protocolo solo proporciona una guía, y debe modificarse de acuerdo a sus necesidades específicas 

1. Preparar la solución de teñido

(1) Preparar la solución de stock: Preparar la solución de stock Mag-Fura-2 AM con una concentración de 1-10mM en DMSO anhidro de alta calidad. Nota: Aliquote la solución de caldo no utilizada y sórdela en la oscuridad a -20°C o -80°C para evitar la congelación y descongelación repetidas.

(2) Preparar la solución de trabajo: Diluir la solución de producción con un tampón adecuado (como medio de cultivo libre de suero y rojo de fenol o PBS) para preparar una solución de trabajo con una concentración de 1-10μM. Por favor, ajuste la concentración del fluido de trabajo de acuerdo con la situación real, y prepárelo ahora para evitar la congelación y descongelación repetidas. Aviso: La solución de trabajo debe prepararse fresca el día del experimento. Antes de su uso, la solución Mag-Fura-2 AM necesita ser recalentada y centrifugada.

2. Tinción de suspensión celular

(1) Células  de suspensión: centrifugar a 4°C y 1000g durante 3-5 minutos, desechar el sobrenadante y lavar dos veces con PBS o otro tampón, 5 minutos cada vez;

(2) Células adhesivas: lavar dos veces con PBS u otros tampones, añadir tripsina para digerir las células y centrifugar a 1000g durante 3-5 minutos después de que se complete la digestión;

(3) Incubar las células a la temperatura requerida (25°C-37°C) durante 10 minutos para permitir que el gradiente iónico alcance la estabilidad y el equilibrio. Tome 4μl de la solución de almacenamiento Mag-Fura-2 AM y 5μl de 20% Pluronic® F-127, agréguelos a 1ml de medio de cultivo celular y mezcle vigorosamente con vórtice para obtener una solución de dispersión de sonda homogénea. Tome 250μl de la solución de dispersión de la sonda preparada y agrtéguelo a 750μl de medio de cultivo que contenga células, mezcle bien. En este punto, se obtiene una solución de trabajo con una concentración final de 1-5μM basada en la concentración inicial de la solución madre. Incube la sonda durante 15-60 minutos para asegurarse de que las sondas en las células estén completamente desesterificadas.

Nota:

1) La concentración de trabajo recomendad de Mag-Fura-2 AM en la mayoría de las células es de 1-5μM, y la concentración específica debe optimizarse de acuerdo con los requisitos experimentales. Para evitar la citotoxicidad causada por la sobrecarga, utilice la concentración de sonda más baja posible en función del logro de resultados efectivos;

2) (Opcional) Si las células contienen transportadores de aniones orgánicos, es posible que deba agregar probenecida (1-2.5mM) o sulfinpyrazone (0.1-0.25mM) al medio de cultivo celular. Para reducir el nivel de fuga de la sonda de desesterificación. La solución de stock de probenecid o sulfinpirazona es alcalina, por lo que el pH debe reajustarse después de agregar el medio de cultivo;

3) Si se utiliza un medio que contiene suero, la lactonasa sérica degradará ag-Fura-2 AM, reduciendo así el efecto de carga de tinte. Mientras que el medio que contiene rojo de fenol hará que el valor de fondo sea ligeramente más alto. Lave las células de 2 a 3 veces antes de añadir la solución de trabajo de tinción;

4) Bajar la temperatura de carga de la sonda puede reducir la compartimentación de la sonda. 

(4) Seleccione el instrumento apropiado y realice la medición de fluorescencia (E_x/E_m=336/503nm).

3. Tinción de adhesión celular

(1) Células adherentes al cultivo en cubiertos de labios estériles;

(2) Retire la cubierta del medio de cultivo, aspte el exceso de medio de cultivo y coloque la cubierta en un ambiente húmedo;

(3) Incubar las células a la temperatura requerida (25°C-37°C) durante 10 minutos para permitir que el gradiente iónico alcance la estabilidad y el equilibrio. Tome 4μl de la solución de almacenamiento Mag-Fura-2 AM y 5μl de 20% Pluronic® F-127, agréguelos a 1ml de medio de cultivo celular y mezcle vigorosamente con vórtice para obtener una solución de dispersión de sonda homogénea. Tome 250μl de la solución de dispersión de la sonda preparada y agréguelo a 750μl de medio de cultivo que contenga células, mezcle bien. En este punto, se obtiene una solución de trabajo con una concentración final de 1-5μM basada en la concentración inicial de la solución madre. Incube la sonda durante 15-60 minutos según los reguisitos. Lave las células 3 veces y luego continúe incubando durante 30 minutos para asegurarse de que las sondas en las células estén completamente desesterificadas. 

(4) Seleccione el instrumento apropiado y realice la medición de fluorescencia (E_x/E_m=336/503nm).

4. Precauciones:

(1) Todos los tintes fluorescentes tienen problemas de extinción. Por favor, evite la luz tanto como sea posible para ralentizar la extinción de la fluorescencia. 

(2) Por su seguridad y salud, use una bata de laboratorio y guantes desechables cuando opere 

(3) Mag-Fura-2 AM debe almacenarse en la oscuridad durante todo el experimento.

(4) Este protocolo y todos los reactivos son solo para uso de investigación cinetífica.