PKH 26

1.Transfiera las células a un tubo de poliestireno y lávelas dos veces con medio sin suero antes de teñirlas.

2.A continuación,las células se resuspendenben tampón de carga (una solución osmorreguladora acuosa sin Ca²⁺ u otras sales normales)y se incuban con PKH-26 recién preparado(reserva de 1 mM en etanol)durante 40min a la temperatura ambiente.

3.Para la carga de las céculas tumorales,se recomienda utilizar 0.8 μl, en tampón de carga de 200μl y 0,5μl de PKH 26 para las células pequeñas(linfocitos).Agregue lentamente esta solución de tinte mientras agita la suspensión celular en un agitador para evitar teñir demasiado las células.

4.Después de agitar a la temperatura ambiente durante 30-40minutos,se completa la carga de las células objetivo.

5.Incubar con suero humano de 500μl durante 30s a la temperatura ambiente para detener la reacción de tinción.Este paso se recomienda para unir la mayor parte del colorante lipofílico PKH-26 restante a las proteínas séricas.

6.Después de la centrifugación,transfiera el gránulo celular a un tubo nuevo de 50ml y lávelo dos veces con medio de 40ml que contenga un 10% de suero humano.Esimportante seguir el procedimiento de lavado para eliminar completamente todo el PKH-26 del sobrenadante.

7.La coincubación de las células efectotas y las células diana debe realizarse en un medio de cultivo de las células efectoras.Las células diana marcadas conPKH-26 (5×10³) se sembraron en 100 μl medio/pocillo.

8.Las células se recolectan y tiñen con ann-FITC y Pl.Después de la coincubación,las células se recolectan en tubos de poliestireno separados.

9.Añadir 1 ml de solución salina tamponada con fosfato(PBS) y centrifugar las células.Luego, las células se resuspendieron en 100 ul de tampón de unión a anexina V con alto contenido de calcio.Tinción con 5μl ann-FITC a la temperatura ambiente en la oscuridad durante 10 minutos.

10.Realice análisis FACS.Excitación a 488nm y fluorescencia de OKH-26 s 585 nm,Para compensar,se deben prepara las células sin teñir y teñidas con PKH-26.

Este acuerdo es solo una guía y debe modificarse de acuerdo con sus necesidades específicas.

1.Las células se inocularon en placas de 6 pocillos y se cultivaron en medio.

2.Lavar con PBS dos veces e incubar con solución 1:250 (v/v) PKH26 durante 3 minutos.

3.Reemplace el medio de cultivo con BSA y bloquee la tinción.

4.Paso oportuno según la proliferación celular.

5.Examine las placas diariamente con un microscopio de contraste de fase para evaluar la formación de estructuras esféricas y tomar las fotografías.

6.Las células teñidas con PKH26 se observaron con microscopio de fluorescencia y las imágenes se tamaron con microscopio confocal.

Este protocolo solo proporciona una guíà y debe modificarse de acuerdo con sus necesidades específicos.

1.Para marcar fluorescentemente los exosomas,vuelva a suspender en 1 ml de sedimento de exosoma de Diluyente C e incube 1 ml de Diluyente C con 4 μL de PKH-26 durante 4min.Luego,detenga la reacción de etiquetado con BSA al 10%.Los exosomas marcados se aislaron y purificaron mediante ultracentrifugación en gradiente de densidad de sacarosa(41,000 RPM durante120 min a 4℃).

2.Inyección intravítrea de exosomas.A los ratones C57BL/6J 4-6-semanas-de edad se les inyectaron intravítreos con ecosomas marcados con PKH-26.Los modelos de ratón CNV(neovascularización coroidea)inducidos por láser se trataron con exosomas inyectables intravítreos tres días después de la fotocoagulación con láser.Para la inyección intravítrea,anestesiar a los ratones con IP ketamine (100 mg/mL)/xylazine (100 mg/mL) y dilatar las pupilas con fenilefrina al 2.5%/ ciclopentosionato al 1%Se hace uan pequeña incisión escleral detrás del limno con una aguja de insulina de calibre 31(G).Luego,se administró 1 μL (10⁶ partículas de exosoma/1 μL) de la solución en la cavidad vítrea a través del mismo puerto utilizando una aguja roma de 33G conectada a una jeringa NanoFil de 10μL.

3.Inyección intravenosa de exosomas.A las ratones C57BL/6J 4-6-semana de edad se les inyectaron exosomas marcados con PKH-26 (5×10⁷ partículas de exosomas/50 μL).

4.In Análisis de imágenes in vivo.La fotografía de fondo de ojo, la microscopía de imágenegs retinianas in vivo y la angiografía con fluoresceína(FA) se realizaron utilizando el sistema de imágenes de retina Micron IV.Anestesiar a los ratones con IP ketamine (100 mg/mL)/xylazine (100 mg/mL) y dilatar laspupilas con fenilefrina al 2.5%/ ciclopentosionato al 1%.Para la FA, los ratones reciben una inyección intraperitoneal de fluoresceína de sodio al 10%.Tomografía de coherencia óptica(OTC) mediante OTC.

Este protocolo solo proporciona una guíà y debe modificarse de acuerdo con sus necesidades específicos.

References:

[1]. Fischer K, Mackensen A. The flow cytometric PKH-26 assay for the determination of T-cell mediated cytotoxic activity. Methods. 2003 Oct;31(2):135-42. doi: 10.1016/s1046-2023(03)00123-3. PMID: 12957571.

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