1. Descripción general en
Detección de cuantificación de ARN de RiboGreen, se requieren dos concentraciones diferentes de tinte para obtener un rango cinético lineal completo. Antes de preparar la solución de trabajo RiboGreen (ver preparación del reactivo a continuación), es necesario decidir si realizar un ensayo de alto rango (20ng/ml-500ng/ML ARN), un ensayo de bajo rango (1ng/mL-50ng/ML ARN) o ambos rangos.
2. Preparación de reactivos
El día del experimento, la solución de trabajo soluble en agua de RiboGreen se preparó en un tubo de plástico de polipropileno desechable estéril. Evite usar cristalería, ya que RiboGreen puede adherirse a las superficies de vidrio. La solución de trabajo RiboGreen preparada debe almacenarse lejos de la luz. Es mejor usar el líquido de trabajo unas pocas horas después de la preparación, y no almacenarlo para un uso a largo plazo.
3. Preparar la curva estándar de ARN
Para la curva estándar, se pueden usar estándares comerciales de ARN, como el ARN ribosómico 16S y 23S de uso común; u otros productos de ARN purificado. A veces, se recomienda utilizar estándares de ARN similares a la muestra que se está probando para establecer una curva estándar. En términos generales, la gran mayoría de las moléculas de ARN de una sola cadena pueden producir señales de fluorescencia casi equivalentes. En presencia de compuestos comunes que contaminan reactivos de ácido nucleico como nucleósidos, sales, urea, etanol, cloroformo, detergentes, proteínas y agarosa, los resultados de detección de RiboGreen aún pueden mantener una buena relación lineal, incluso si la intensidad de fluorescencia puede verse afectada. Para garantizar un control efectivo, la solución de ARN utilizada para preparar la curva estándar debe ser consistente con la muestra a analizar, lo que puede garantizar la presencia de compuestos de impurezas a niveles similares.
3.1 Prepare una solución de ARN de 2 μ g/mL en una botella de plástico usando un tampón 1xTE. Mida la absorbancia básica de la solución de ARN a 260 nm (A260) usando una copa colorimétrica en una vía de 1 cm de largo. A260=0,05 es equivalente a una concentración de 2 μ g/mL de ARN A.
3.2 Al preparar la curva estándar de alto rango, se prepara una serie de soluciones estándar de ARN de concentración final 2x diluyendo una solución de ARN de 2 μ g/mL en un tubo de plástico desechable libre de nucleasa, y finalmente se transfiere a un plato colorimétrico o a una placa de cultivo.
3.3 Al preparar la curva estándar de rango bajo, se prepara una serie de soluciones estándar de ARN de concentración final 2x diluyendo una solución de ARN de 2 μ g/mL en un tubo de plástico desechable libre de nucleasa, y finalmente se transfieren a un plato colorimétrico o plato de cultivo.
3.4 Mezcle volúmenes iguales de solución de trabajo de reactivo RiboGreen (ver Preparación de 2-Reactivos) y solución estándar de 2xARN. Incubar a temperatura ambiente en la oscuridad durante 2-5 minutos, asegurándose de que se añada un volumen suficiente de solución de medición al recipiente de medición. Para una placa colorimétrica de 10x10 mm, no debe ser inferior a 2 ml; para cada agujero de la placa de 96 pozos, no la baje más de 200 μ L.
3.5 Elija usar un espectrofotómetro de fluorescencia o un lector de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas de fluorescencia (ELISA) para medir el valor de fluorescencia de la muestra y seleccione la longitud de onda de fluorescencia estándar (excitación ~480 nm, emisión ~ 520 nm).
3.6 Reste el valor de fluorescencia en blanco del valor de fluorescencia de cada muestra. Después, use los valores de fluorescencia calibrados como el eje y y la concentración de ARN como el eje x para establecer una curva estándar.
4. Análisis de muestra
4.1 Diluir la muestra con un tampón de 1xTE a un volumen apropiado (p. ej. Cubeta de 1,0 ml a 10x10 mm o microplaca de 100 μ L a 96 pozos). Es mejor hacer más de un factor de dilución para cada muestra a analizar. Cuanto mayor sea el factor de dilución de la muestra de prueba, más útil será reducir la interferencia de contaminantes específicos. Sin embargo, también es necesario evitar volúmenes de muestra particularmente pequeños, ya que son difíciles de medir con precisión. Además, en el mismo experimento, los niveles de impurezas deben mantenerse lo más consistentes posible para reducir las diferencias de señal entre las muestras causadas por las impurezas. Por ejemplo, si una serie de muestras de ARN tiene concentraciones de sal significativamente diferentes, no se pueden comparar usando una curva estándar simple. Para evitar tales problemas, si es posible, ajuste la concentración de impurezas en todas las muestras al mismo nivel. (Ver 5- Eliminación de ADN en la muestra)
4.2 Agregue un volumen igual de reactivo de medición RiboGreen (ver Preparación de 2-Reactivos) a cada muestra e incube a temperatura ambiente en la oscuridad durante 2-5 minutos.
4.3 Seleccione los mismos parámetros del instrumento que la medición de la curva estándar para determinar el valor de fluorescencia de la muestra. Con el fin de reducir el efecto de fotoblanqueo, el tiempo de medición de fluorescencia de todas las muestras permanece sin cambios.
4.4 Reste el valor de fluorescencia en blanco del valor de fluorescencia de cada muestra. Determine la concentración de ARN de la muestra en función de la curva estándar de ARN generada. Si es posible, verifique los resultados cuantitativos diluyendo diferentes muestras y repitiendo las mediciones.
5. Eliminación de ADN en la muestra
RiboGreen también puede unirse al ADN, y las DNasas libres de ARN se pueden usar para eliminar el ADN de la muestra primero, evitando así la interferencia de fluorescencia causada por la unión del ADN y RiboGreen, asegurando que toda la fluorescencia en la muestra provenga de la unión de RiboGreen y ARN.
5.1 Prepare 10x tampón de digestión DNase: 200mM Tris HCl sin nucleasa, pH 7,5,100 mM MgCl2,20 mM CaCl2.
5.2 Agregue 0,11 veces el volumen de tampón de digestión de 10xDNasa a cada muestra que contenga ADN. (Por ejemplo, si la muestra es de 9 ml, agregue 1 ml de tampón 10x).
5.3 Agregue ~5 unidades de DNasa sin RNasa a 1 μ g de ADN.
5.4 Incubar a 37 °C durante 90 minutos.
5.5 Diluir la muestra al menos 10 veces con un tampón 1xTE para reducir la interferencia de los iones de sal residuales en la solución de digestión en las mediciones de RiboGreen.
5.6 Realice el experimento del ensayo RiboGreen de acuerdo con los pasos anteriores.
