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Marquage d'acides aminés non-naturels dans les cellules vivantes via chimie de click azide-alcyne[1].
1.Culture cellulaire:
24 heures avant la transfection, les cellules HEK293T ont été cultivées sur des couvre-verres en verre revêtus de poly-lysine de 18 mm, et le le milieu de culture cellulaire a été changé pour être supplémenté avec 0.65mM 4-Azido-L-phenylalanine (p-Azidophenylalanine), milieu de croissance.
2.Expériences de transfection
Le plasmide pIRE4-Azi plasmid (1:1 w/w) a été transfecté dans les cellules à l'aide du réactif Lipofectamine 3000. Après 24 heures, le milieu de croissance a été rafraîchi avec 0.65mM 4-Azido-L-phenylalanine (p-Azidophenylalanine) et les cellules ont été cultivées pendant 24 heures supplémentaires (expression totale de 48 heures). 30 minutes avant le marquage, le milieu de croissance supplémenté en 4-azido-L-phenylalanine a été retiré, et les cellules ont été lavées deux fois par une solution de tampon extracellulaire contenant 128mM NaCl, 2mM KCl, 2.5mM CaCl2, 1.2mM MgCl2, 10mM saccharose, 10mM HEPES, et à pH7.4 et ont été conservées dans un milieu de croissance sans 4-azido-L-phenylalanine.
3.Marquage d'acides aminés non-naturels dans les cellules vivantes via chimie de click azide-alcyne
3.1Préparation des solutions de stock
Sulfo-Cyanine3.5 alkyne (numéro de catalogue: GC59209) colorants alcyne 10mM dans DMSO, BTTES (Click Chemistry Tools) 50mM, sulfate de cuivre (numéro de catalogue: GB57835) 20mM, Aminoguanidine (numéro de catalogue: GC15727) 100mM, and (+)-ascorbate de sodium L- (numéro de catalogue: GC13616) 100mM dans de l'eau distillée ultrapure.
3.2Clickez sur Réaction Chimique
A.Dans 656µl solution de tampon extracellulaire, Cy3.5 a été mélangé à la concentration finale de 20µM. Une solution fraîche de sulfate de cuivre et une solution BTTES (rapport molaire 1:5) ont été pré-mélangées, ont été ensuite ajoutées à la concentration finale de 150µM. Puis, ajouter Aminoguanidine à la concentration finale. Le volume total de marquage est 0.7mL;
B.Incuber le mélange de marquage complété à 4°C pendant 8 minutes, ensuite à la température de chambre pendant 2 minutes et à l'obscurité avant d'ajouter aux cellules. Laver les cellules avant d'ajouter le mélange de marquage. Pendant le marquage, garder les cellules en obscurité à 37°C et 5% de CO2 pendant 10-15 minutes. Après le marquage, laver les cellules deux fois avec un tampon extracellulaire. Les produits marqués à 591/604nm à l'aide de la microscopie confocale.
References:
[1].Schamber M R, Vafabakhsh R. Mechanism of sensitivity modulation in the calcium-sensing receptor via electrostatic tuning[J]. Nature communications, 2022, 13(1): 2194. |
