Cell Counting Kit-8 (CCK-8) Plus

Ce protocole fournit seulement une ligne de guide, veuillez le modifier pour correspondre vos besoins spécifiques.

Détermination du nombre de cellules

1. Inoculer une suspension cellulaire (100µL/puits) dans une plaque à 96-puits. Pré-incuber la plaque dans un incubateur humidifié (par exemple, à 37°C, 5% CO₂).

2. Ajouter 10µL solution CCK8 à chaque puits de la plaque. Prendre attention à ne pas introduire de bulles dans les puits, car celles qui interfèrent avec la lecture d’ OD.

3. Incuber le substrat pendant 0,5-1 heure dans l’incubateur.

Note : Par rapport à la version ordinaire de CCK-8 (numéro de catalogue GK10001), ce kit a été optimisé et est plus sensible. Ce qui est recommandé de terminer le test dans 0,5-1 heure. Si les cellules croissent trop lentement, augmenter la durée d’incubation à 3 heures.

4. Mesurer l’absorbance à 450nm par utiliser le lecteur de plaques.

L’essai de prolifération cellulaire et de cytotoxicité

1. Ensemencer les cellules dans une plaque à 96-puits à la densité de 10³-10⁴ cellules/puits dans 100µL substrat à tester . Cultiver les cellules dans un incubateur à  CO₂  à 37°C pendant 24 heures.

2. Ajouter les concentrations variées de substances à tester dans la plaque.

3. Incuber le substrat pendant une durée appropriée (par exemple, 6,12,24 ou 48 heures) dans l’incubateur.

4. Ajouter 10µL solution CCK8 à chaque puits de la plaque par utiliser un pipettor répetitif. Prendre attention à ne pas introduire de bulles dans les puits, car celles qui interfèrent avec la lecteur d’ OD.

5. Incuber le substrat pendant 0,5-1 heure dans l’incubateur.

Note : Par rapport à la version ordinaire de CCK-8 (numéro de catalogue GK10001), ce kit a été optimisé et est plus sensible. Ce qui est recommandé de terminer le test dans 0,5-1 heure. Si les cellules croissent trop lentement, augmenter la durée d’incubation à 3 heures.

6. Avant de lire la plaque, c’est important de la mélanger doucement sur un agitateur orbital pendant 1 minute pour s’assurer d’une distribution homogène de la couleur.

7. Mesurer l’absorbance à 450 nm par utiliser un lecteur de plaques.

L’analyse des données

Plusieurs méthodes d’analyse statisque sont existes. Vous pouvez choisir d’utiliser les valeurs d’ OD (densité optique) ou le nombre de cellules. Nous fournissons l’une d’entre elles.

Viabilité cellulaire (%) = [(As-Ab) / (Ac-Ab)] × 100

Ratio d’inhibition (%) = [(Ac-As) / (Ac-Ab)] × 100

As = l’absorbance du puits expérimental (absorbance des cellules, du milieu, de CCK8 et des puits du composé testé).

Ab = l’abosrbance du puits qui contiennent le substrat et CCK8).

Ac = l’absorbance du puits de témoin ( absorbance des puits qui contiennent les cellules, le substrat et CCK8).

Préparation d’une courbe standard

1. Compter la quantité de cellules dans la suspension cellulaire par utiliser la plaque de comptage cellulaire.

2. Diluer la suspension cellulaire dans le substrat pour obtenir un gradient de concentrations. Habituellement, 5-7 gradients de concentrations sont nécessaires, avec plusieurs puits de répétion par groupe. Ensuite, inoculer les cellules (Noter le nombre de cellules par puits. Si vous diluez la suspension cellulaire dans un tube, mélangez soigneusement les cellules à nouveau avant d’ajouter le contenu aux puits de la plaque. Le volume de la suspension cellulaire dans chaque puits doit être le même.)

3.Incuber jusqu’à ce que les cellules adhèrent (habituellement 2-4 heures), puis ajouter 10µl CCK8 pour chaque 100µl de milieu. l'incubation est continuée pendant 0,5 - 1 heure (si les cellules croissent trop lentement, augmenter la durée d'incubation à 3 heures), puis mesurer l'absorbance à 450 nm par utiliser un lecteur de plaques. Tracer une courbe standard par utiliser la quantité de cellules en tant que coordonnée de X-axes et la valeur d'OD (densité optique) en tant que coordonnée de Y-axes. Le nombre de cellules de l'échantillon à tester peut être déterminé en fonction de cette courbe. Une condition préalable d’utiliser cette courbe standard est que les conditions de culture soient identiques.

Précautions

1. S’assurer que le médicament et le CCK8 sont répartis de manière homogène dans le substrat.

2. Plus les cellules prolifèrent, plus la couleur est foncée ; plus la cytotoxicité est forte, plus la couleur est claire.

3. Pour les cellules adhérentes, il faut au moins 1000 cellules par puits (100 μl de milieu). Pour les leucocytes, en raison de leur faible sensibilité, au moins 2500 cellules par puits (100 μl de milieu) sont requises. La plaque à 96 puits recommandée possède un nombre maximal de cellules de 25 000 par puits. Si l'expérience est effectuée avec une plaque à 24 puits ou à 6 puits, calculez la quantité correspondante de cellules par puits et rajustez le volume de CCK8 à 10 % du volume total de liquide par puits.

4. Parce que l'essai CCK8 est basé sur l'activité de la déshydrogénase dans les cellules vivantes, la condition ou le produit chimique qui affectent l'activité de la déshydrogénase peuvent entraîner une différence entre le nombre réel de cellules viables et le nombre de cellules viables mesuré par utiliser CCK8.

5. WST-8 peut réagir avec un agent réducteur pour former le formazan de WST-8. Si un agent réducteur (tels que certains antioxydants) est utilisé, il interférera avec l'essai. Si plus d'agent réducteur est présent dans le système à tester, c’est nécessaire de le supprimer.

6. Après 2 heures d'incubation, la valeur d'OD (densité optique) de fond est généralement de 0,1 - 0,2 unités.

7. Prendre attention à ne pas introduire de bulles d'air dans les puits, car celles qui interféreront avec la valeur d'OD.

8. Si vous voulez stériliser la solution CCK8, utilisez une membrane filtrante de 0,2μm.

9. Si la suspension cellulaire présente une forte turbidité, mesurer et déduire la valeur d'OD de l'échantillon à 600 nm ou plus.

10. CCK8 ne peut pas être utilisé pour la coloration des cellules.

11. Le phénol rouge dans le milieu n'affecte pas les résultats de l'expérience. L'absorbance du phénol rouge peut être éliminée par soustraire l'absorbance du fond dans le puits de blanc lors des calculs, de sorte que ce qui n'affectera pas la détection.

12. La toxicité de CCK8 est très faible. Une fois l'essai CCK8 terminé, les mêmes cellules peuvent être utilisées pour l’autres essais de prolifération cellulaire, tels que l'essai à la violette de cristal, l'essai au rouge neutre ou l'essai d'imagerie de DNA de fluorescence. (Sauf si les cellules sont extrêmement rares, il n'est pas recommandé de les réutiliser.)

13. Ce kit peut être utilisé par E. coli, mais pas par les cellules de levure.

14. Avant de lire la plaque, vous pouvez la mélanger doucement sur un agitateur.

15. Nous recommandons d'inoculer les cellules dans les puits proches du centre de la plaque. Le milieu dans le cercle externe des puits s'évapore facilement et peut être remplacé par PBS, de l'eau ou le substrat.

16. Si vous n'avez pas de filtre à 450 nm, vous pouvez également utiliser les filtres avec une longueur d'onde d'absorption comprise entre 430 et 490 nm, mais les filtres à 450 nm offrent la sensibilité optimale.

17. Mesurer l'absorbance à 450 nm. Si vous devez effectuer une mesure à double longueur d'onde, l'absorbance à 650 nm peut être déterminée en tant que longueur d'onde de référence.

18. La présence d'ions métalliques dans le médicament probablement peut affecter la sensibilité de CCK8. Le chlorure de plomb, le chlorure de fer et le sulfate de cuivre à la concentration finale de 1 mM inhibent respectivement 5 %, 15 % et 90 % de la réaction de coloration, ainsi donc, réduire la sensibilité. Si la concentration finale est 10 mM, la réaction est inhibée à 100 %.

Les questions fréquemment posées :

Q : Comment créeer un témoin de blanc?

A : Vous pouvez utiliser les puits qui contiennent la quantité correspondante de substrat cellulaire et de CCK - 8, mais sans cellules, en tant que témoin de blanc. Si vous craignez que les médicaments utilisés interfèrent avec l'essai, vous devriez configurer les puits contenant la quantité correspondante de substrat cellulaire, de médicaments et de CCK - 8, mais sans cellules, en tant que témoin de blanc.

Q : Pour les puits de blanc qui contiennent seulement CCK - 8 mais pas cellules, pourquoi la valeur augmente - t - elle?

A : Tout au long de l'expérience, avec le temps, si la durée de culture des cellules est longue, prendre attention à problèmes d'évaporation. En raison de la température élevée de l'environnement de réaction, une partie du liquide s'évapore. Bien que les puits du groupe de blanc ne contiennent pas les cellules, à mesure que le liquide s'évapore, la concentration du médicament augmente en équivalence, de sorte que la valeur du témoin de blanc changera également légèrement (mais sans variation évidente). Si vous êtes très préoccupé par la valeur du témoin de blanc, vous pouvez ajouter le substrat , de l'eau ou PBS au cercle externe de la plaque à 96-puits pour la conserver humide. En même temps, vous pouvez placer la plaque à 96-puits près du plateau à eau dans l'incubateur pour réduire l'évaporation. Utilisez PBS pour remplir les deux cercles externes de la plaque à 96-puits, de sorte que l'évaporation affectera d'abord les alentours, ce qui peut minimiser l'impact sur les échantillons internes et les témoins de blanc.

Q : Combien de la fréquence de la mesure de valeur ?

A : Dans l'expérience préliminaire, vous pouvez utiliser un lecteur d'enzyme pour détecter après 0,5 heure et 1 heure, puis sélectionner un point de temps avec une plage d'absorbance plus appropriée pour les expériences ultérieures. Si les cellules croissent trop lentement, augmentez la durée d'incubation jusqu'à 3 heures.

Q : Après avoir ajouté CCK8, si la valeur d'OD (densiité optique) n'est pas immédiatement mesurée, comment peut - on la conserver temporairement? Combien de temps peut - on la conserver?

A : Si vous n'avez pas besoin de mesurer immédiatement la valeur d'OD, vous pouvez ajouter 10 μl solution d'HCl 0,1 M ou de solution SDS 1 % p/v à chaque puits, la conserver à la température de chambre loin de la lumière, et l'absorbance ne changera pas pendant 24 heures.

Q : Comment conserver CCK8?

A : La solution CCK8 peut être conservée pendant 1 an dans les conditions en obscurité et à la température qui est entre 0 et 5 °C. Si celle n'est pas utilisée pendant longtemps, celle peut être conservée à - 20 °C, éviter de la lumière, pendant 2 ans. C’est recommandé de la conserver à - 20 °C après avoir effectué des aliquots et de la décongeler à 4 °C à l'avance avant utilisation. Veuillez éviter les cycles de congélation et de décongélation répétés, sinon la valeur de fond augmentera et interférera avec les résultats de l'expérience.

Q : Dois - je changer le substrat?

A : Non, si l'effet du médicament est relativement faible, vous n'avez pas besoin de changer le substrat. Vous pouvez simplement déduire l'absorption du blanc après avoir ajouté le médicament au substrat.

Q : Que faire si la substance testée est oxydante ou réductrice?

A : La détection de ce kit dépend de la réaction catalytique de la déshydrogénase. Si la substance testée est oxydante ou réductrice, c’est possible de remplacer le substrat  frais avant d'ajouter CCK8 pour éliminer l'influence du médicament. Si un agent réducteur est présent dans l'expérience, veuillez vérifier la valeur d'OD (densité optique) de fond, c'est - à - dire, ajouter le médicament au substrat sans cellules, puis ajouter le réactif CCK8 et le tester pendant une certaine période de temps, puis le comparer au substrat sans médicament (ne contient que le réactif CCK8). Si la valeur d'OD est clairement plus élevée, cela signifie qu'il y a une réaction.

Q : Si la couleur ou pH du substrat ont changé, dois - je remplacer le substrat par un nouveau?

A : Lorsque vous ajoutez du CCK8, si la durée de culture des cellules est longue et que la couleur ou la valeur de pH de substrat ont changé, c’est recommandé de le remplacer par un substrat frais.

Q : Les cellules applicables?

A : Parce que les enzymes mitochondriales sont mesurées, la cellule eucaryote dotée de mitochondries est toute convenable, telles que les cellules unicellulaires et les cellules animaux. Cependant, les cellules dotées de parois cellulaires, telles que les cellules végétales et les cellules de levure, possèdent une faible efficacité d'entrée du substrat dans les cellules et ne sont pas recommandées.

Q : Quelles sont les raisons d'une mauvaise linéarité?

A : Cellules inhomogènes ; évaporation du substrat ; agent réducteur ; bulles ; la partie autour de la plaque à puits ne peut pas être utilisée, sauf si la culture ne dure que moins d'un jour ; le nombre de cellules est très important, trop peu de cellules entraînera un faible signal.

Q : Toxicité métallique?

A : La toxicité métallique peut être détectée, et c’est préférable de faire un témoin de blanc.

Q : Pour quelles cellules est - il applicable? Quelles autres cellules peuvent être utilisées? Les bactéries vivantes dans des biofilms (Haemophilus influenzae et Pseudomonas aeruginosa)?

A : Toutes les cellules mammifères. En général, les bactéries qui ne sont pas détectées avec CCK8 peuvent être utiliser une méthode de coloration ou la cytométrie en flux, la méthode la plus courante. Il existe les rapports sur la méthode turbidimétrique pour mesurer OD600.

Q : Peut - il remplacer la méthode Brud ou EDU pour détecter la prolifération cellulaire?

A : Bien que le CCK8 réagisse à l'activité cellulaire par détecter la déshydrogénase dans les cellules pendant la processs de croissance, et que la méthode d'insertion de thymine détecte l'activité cellulaire par insérer les analogues de nucléotides dans DNA synthétique, ces méthodes sont liées à un certain degré. CCK8 peut remplacer la méthode d'insertion de thymine pour détecter la prolifération cellulaire, et la détection est plus pratique.

Q : La valeur du puits de blanc est élevée. Est - il possible que le substrat soit contaminé par les bactéries? Ou l’autres raisons?

A : Une valeur élevée du puits de blanc est généralement considérée comme être causée par une contamination bactérienne, et ce problème survient rarement.

Q : CCK8 peut - il détecter des tissus?

A : Il ne peut pas détecter les tissus.

Q : Les cellules T peuvent - elles être détectées?

A : Oui, les cellules T croissent lentement et la durée d'incubation doit être prolongée.

Q : Lorsque deux types de cellules sont mélangés et cultivés (l'un est des cellules mésenchymateuses osseuses et l'autre est des cellules T suspendues), après une période de culture, seule la croissance et la prolifération des cellules souches mésenchymateuses osseuses sont mesurées. CCK8 peut - il être utilisé pour la mesure? Comment faire?

A : Dans le cas de deux types de cellules :

1. Si on mesure la croissance des cellules adhérentes, les cellules T suspendues peuvent être transférées et mesurées par utiliser la deuxième méthode mentionnée ci - dessus.

2. Si les cellules T sont essentielles à la croissance des cellules mésenchymateuses et ne peuvent pas être éliminées, alors le niveau d'activité mesuré est la quantité totale. Dans ce cas, c’est nécessaire d'estimer la quantité de cellules T dans chaque puits. Si la quantité totale de cellules T dans chaque condition de culture est similaire, ou si la teneur en cellules T est très faible et beaucoup inférieure à celle des cellules mésenchymateuses, on peut également mesurer. L'utilisation de puits de témoin peut éliminer l'influence des cellules T.

3. Si les cellules T peuvent être éliminées en peu de temps, vous pourrez utiliser CCK8 à haute sensibilité et à signal fort. C’est recommandé d'obtenir le résultat de lecture environ 30 minutes après, lorsque la quantité de cellules est appropriée (10 000 cellules par puits). Après la mesure, les cellules T peuvent être ajoutées au puits de culture. Cela n'aura pas beaucoup d'effet sur la croissance des cellules. Cependant, si la dynamique est utilisée, il y a plus de facteurs à considérer.

Q : CCK8 reflète le nombre de cellules par réagir avec la déshydrogénase dans les cellules. Si les cellules sont mortes mais que l'activité de la déshydrogénase est toujours présente, comment calculer la quantité de cellules?

A : En la plupart des cas, dans le processus de mort cellulaire, les composants dans les cellules se dégradent et la déshydrogénase est partiellement libérée, mais son activité est inférieure à celle des cellules vivantes. Par exemple : après que 100 cellules meurent pendant 20 heures, l'activité de déshydrogénase libérée est inférieure à l'activité de déshydrogénase de 5 cellules vivantes, c'est - à - dire, l'erreur causée par cette situation est inférieure à 5 %. D’ailleur, ce type de mort cellulaire est le même pour le même type de cellules. En général, on compare le même type de cellules entre différents puits, de sorte que l'erreur systématique est la même, c'est - à - dire, l'erreur systématique s'annule.