Collagenase IV (Synonyms: Collagenase; collagen hydrolase)

Protocole pour l'isolement de cellules individuelles par collagenase IV pour l'analyse à l'aide de cytométrie en flux ^[1]:

1.Les échantillons endométriaux ont été hachés en fragments de 1 mm3 et ont été digérés pendant 30 minutes à 37°C avec 1 mg/mL collagenase IV, 0.2 mg/mL DNase, et 1 mg/mL albumine sérique bovine dans DPBS.

2.La suspension cellulaire a été passée à travers un filet, lavée dans PBS, traité par tampon ACK (0.01 M KHCO₃-tamponée 0.16 M, NH₄Cl, 0.1 mM acide éthylènediaminetétraacétique [EDTA]) pour éliminer les globules rouges, lavée et resuspendue dans PBS.

3.Les cellules isolées ont été incubées avec immunoglobuline humaine pendant 10 minutes et ont été colorées par anticorps fluorescents contre les antigènes spécifiques de différentes populations de cellules immunitaires.

4.Après 30 minutes d'incubation à 4°C, les cellules ont été lavées, resuspendues dans un tampon pour cytométrie à activation de fluorescence (FACS) et ont été analysées sur un cytomètre de flux FACS sort. Les cellules non-marquées et les anticorps isotype correspondants ont été utilisés en tant que témoin.

Ce protocole fournit seulement une ligne directrice et doit être modifié en fonction de vos besoins spécifiques.

Protocole pour l'isolement et l'extraction d'hépatocytes primaires de rats au moyen de perfusion de collagenase Ⅳ ^[2]:

Perfusion en deux étapes

(1)Préparation : la solution de perfusion et la culture DMEM à haute teneur en glucose ont été préchauffées dans un bain-marie à 42°C pendant 30 minutes pour préparer la table de laboratoire animale et les instruments chirurgicaux, et la table de travail aseptique a été irradiée à la lumière ultraviolette pendant 30 minutes. Le tube de la pompe péristaltique circule avec la solution de perfusion de collagénase 1 pour éviter les bulles.

(2)Préparation des solutions : perfusion de collagénase 1 : EDTA 0.5 mmol/L, D-Hanks 10 mL; Perfusion de collagénase 2 : protéase E₃ 2mg, solution Hanks 8mL; solution de perfusion de collagénase 3 : Collagenase Ⅳ 4.8 mg, solution Hanks 12.5 mL; solution de nettoyage : DNase I 0.02 mg/mL, solution de sel équilibre de Grignard 50mL; solution purifiée : agent de centrifugation en gradient de densité de polyvinylpyrrolidone (PVP) silicatée à 50%; Milieu complet : insuline 0.5μg /mL, dexaméthasone 100nmol /L, cyanstreptomycine 1%, sérum de veau foetal 10%, milieu DMEM à haute teneur en glucose 200mL.

(3)Perfusion : les rats ont été euthanasiés par l'asphyxie au CO₂ et trempées dans l'alcool pendant 10-20 secondes. Transfert sur une table opératoire stérile. Disséquer les rats, exposer la cavité abdominale et l'ensemble de la cavité thoracique. Liger le segment hépatique supérieur de la veine cave inférieure et insérer l'aiguille horizontalement à partir de la veine cave inférieure. Ouvrir la perfusion et faire une petite incision dans la veine portale. Vitesse de perfusion 3 mL/min;9 ml perfusion de collagénase 1 sont consommés, et le liquide de sortie est clarifié, c'est-à-dire que la perfusion est arrêtée. Transférer le tube de la pompe vers la perfusion de collagénase 2 et continuer la perfusion, consommant approximativement 8 (ou 15) mL perfusion de collagénase 2. Le foie se gonfle progressivement, avec une petite main en verre presser doucement le foie, concave et rebond lent, vous pouvez remplacer par la perfusion de collagénase 3 et consommer 11 mL (ou 21 mL). Si plus de cellules sont nécessaires, le volume et le temps de perfusion peuvent être augmentés.

(4)Séparation : L'agrégation des faisceaux de fibres qui connectent chaque lobe hépatique a été découpée par pincettes, couper le longe du tissu conjonctif, met dans un tube centrifuge contenant la solution de perfusion de collagénase 3, sceller et préchauffer à 42°C pendant 5 minutes. Le foie a été immergé dans une boître de Pétri qui contient un milieu à 10% sérum de veau foetal pour déchirer le foie (décoller doucement l'enveloppe de la feuille hépatique, puis saisir le faisceau de fibres avec pincettes, secouer pour disperser les cellules restantes), et a été filtrée à travers un filtre à 200 mailles, le filtrat était une suspension de cellules hépatiques.

(5)Purification : la suspension de cellules hépatiques filtrée a été transférée dans un tube centrifuge de 50mL et centrifugée à basse température et à faible vitesse (4 ℃, 50×g, 3 min). Eliminer le surnageant, ajouter 15mL solution de nettoyage et souffler doucement pendant 3 fois, répéter la centrifugation 3 fois. Jeter le surnageant, ajouter 10 mL solution purifiée, centrifuger (4℃, 400×g, 10 minutes), éliminer la couche supérieure, le précipité cellulaire restant est les cellules parenchymateuses hépatiques, ajouter 5mL milieu complet pour resuspendre les cellules.

Ce protocole fournit seulement une ligne directrice et doit être modifié en fonction de vos besoins spécifiques.

References:

[1].  Gnainsky Y, Granot I, et,al. Local injury of the endometrium induces an inflammatory response that promotes successful implantation. Fertil Steril. 2010 Nov;94(6):2030-6. doi: 10.1016/j.fertnstert.2010.02.022. Epub 2010 Mar 24. PMID: 20338560; PMCID: PMC3025806.

[2].Ren Wenjie, Lin Zhexuan. Trypsin and collagenase perfusion method of separation of the original generation of liver cells in mice to compare [J]. Journal of shantou university medical college, 2022, 35 (4) : 204-209. The DOI: 10.13401 / j.carol carroll nki jsumc. 2022.04.003.