DBCO-NHS ester

Ce protocole décrit la réaction click sans cuivre entre des protéines modifiées par DBCO-NHS ester et des colorants azotures. Les conditions d'application réelles peuvent nécessiter une optimisation selon le plan d'étude^[1-2].

1 Préparation des réactifs et matériaux

DBCO-NHS ester, protéine cible, colorant fluorescent modifié par azoture, PBS, tampon carbonate.

2 Etapes expérimentales

(1) Modification des protéines par DBCO

Dissoudre la protéine cible dans un tampon carbonate pH 8.5 à une concentration ≥ 1mg/mL. Dissoudre DBCO-NHS ester dans du DMSO anhydre (maintenir la concentration finale de DMSO ≤ 10%) et l'ajouter à la solution protéique avec un rapport molaire DBCO:protéine de 5-20:1. Vortexer et incuber à température ambiante pendant 2h (ou toute la nuit à 4℃) à l'abri de la lumière. Equilibrer la colonne de désalage avec PBS pré-refroidi(pH 7.4), charger le mélange réactionnel et recueillir la protéine purifiée par centrifugation. Déterminer la concentration protéique, aliquotter et congeler à -80℃.

(2) Réaction click DBCO-azoture

Préparer le colorant azoture (ex: Azide-Cy5) dans du DMSO à 1-10mM et conserver à l'abri de la lumière. Mélanger la protéine modifiée par DBCO et le colorant azoture dans du PBS (pH 7.4) avec un rapport molaire DBCO:Azoture = 1:1.5-3. Vortexer et incuber à température ambiante à l'abri de la lumière pendant 1-4h (ou toute la nuit à 4℃). Eliminer le colorant libre par désalage ou dialyse (PBS, 4℃ à l'abri de la lumière). Contrôler par SDS-PAGE (balayage fluorescence) ou spectroscopie UV-visible (calculer le rapport colorant/protéine, DOL).

Notes et précautions

(1) Opérations anhydres: DBCO-NHS ester est hydrolysable. Le dissoudre dans un environnement sec (DMSO dégazé avec de l'azote).

(2) Optimisation du rapport molaire: Un excès de DBCO peut provoquer une agrégation protéique. Tester initialement des rapports 5:1, 10:1, 15:1.

(3) Protection lumineuse et base température: DBCO et colorants sont photosensibles. Manipuler à l'abri de la lumière et purifier à 4℃.

(4) Eviter les interférences: Exclure tout tampon contenant des thiols (DTT, β-mercaptoéthanol) ou azotures.

(5) Vérification en cellules vivantes: Pour un marquage cellulaire, vérifer l'activité biologique de la protéine modifiée et la perméabilité cellulaire du colorant azoture.

References:
[1]. Ciferri MC, Bruno S, Rosenwasser N, et al. Standardized method to Functionalize plasma-extracellular vesicles via copper-free click Chemistry for targeted drug delivery strategies. ACS Applied Bio Materials. 2024 Jan 16; 7(2): 827-838.
[2]. Lee HJ, Fernandes-Cunha GM, Putra I, et al. Tethering growth factors to collagen surfaces using copper-free click chemistry: surface characterization and in vitro biological response. ACS applied materials & interfaces. 2017 Jul 19; 9(28): 23389-23399.