- Méthode de détection au lecteur de microplaques:
1.1Ajouter 10µL de chaque standard de BSA et d’échantillon protéique dans les puits distincts de la microplaque.
Remarque : Si l’échantillon protéique est rare, il peut être dilué de 5 à 10 fois avec PBS, et le facteur de dilution doit être multiplié lors du calcul de la concentration protéique.
1.2Mélanger le réactif A BCA et le réactif B pour préparer le réactif de travail dans un rapport de 50 : 1. C’est-à-dire 50mL de réactif A avec 1mL de réactif B.
Remarque : Utiliser la formule suivante pour déterminer le volume total de réactif de travail nécessaire. Il est recommandé de préparer 1 à 2 puits supplémentaires de réactif de travail: (Standard BSA + échantillon de test) * (Répétitons) * (Volume de réactif de travail BCA par échantillon) = Volume total de réactif de travail fraîchement avant utilisation. A température ambiante, la solution de travail deviendra progressivement vert foncé, mais cela n’affectera pas l’exactitude de la quantification si elle est utilisé dans les 30 minutes.
1.3Ajouter 200µL de réactif de travail BCA dans chaque puits et mélanger.
1.4Sceller la plaque et incuber à température ambiante pendant 5 minutes.
1.5Mesurer l’absorbance à 480nm au lecteur de microplaques.
Remarque : Le temps d’incubation peut être prolongé si nécessaire, mais ne doit pas dépasser 15 minutes lors de la mesure d’un standard BSA à large gamme (0-10mg/mL). Les résultats de ce Kit sont dynamiques - l’absorbance augmente continuellement et la coloration est relativement rapide. Il est également possible d’ajouter 50µL de HCl 1M pour terminer la réaction, prolonger le temps de détection et terminer la détection dans l’heure pour minimiser l’impact sur les résultats.
1.6Soustraire la valeur OD480 de blanc de toutes les valeurs d’absorbance et tracer la courbe standard de BSA: (OD480 sur Y-axis vs. Concentration de BSA sur X-axis). Calculer la concentration protéique de chaque échantillon.
- Méthode de détection spectrophotométrique:
2.1Ajouter 50µL de chaque standard de BSA et d’échantillon protéique dans les tubes EP distincts.
Remarque : Si l’échantillon protéique est rare, il peut être dilué de 5 à 10 fois avec PBS, et le facteur de dilution doit être multiplié lors du calcul de la concentration protéique.
2.2Mélanger le réactif A BCA et le réactif B pour préparer le réactif de travail dans un rapport de 50:1. C’est-à-dire 50mL de réactif A avec 1mL de réactif B.
Remarque : Utiliser la formule suivante pour déterminer le volume total de réactif de travail nécessaire. Il est recommandé de préparer 1 à 2 volumes supplémentaires de réactif de travail : (Standard BSA + échantillon de test) * (Répétitons) * (Volume de réactif de travail BCA par échantillon) = Volume total de réactif de travail BCA.
Remarque : il est recommandé de préparer le réactif de travail fraîchement avant utilisation. A température ambiante, la solution de travail deviendra progressivement vert foncé, mais cela n’affectera pas l’exactitude de la quantification si elle est utilisée dans les 30 minutes.
2.3Ajouter 1000µL de réactif de travail BCA dans chaque tube et mélanger.
2.4Sceller les couvercles et incuber à température ambiante pendant 5 minutes.
2.5Mesurer l’absorbance à 480nm à l’aide d’un spectrophotomètre.
Remarque : Le temps d’incubation peut être prolongé si nécessaire, mais ne doit pas dépasser 15 minutes lors de la mesure d’un standard BSA à large gamme (0–10mg/mL). Les résultats de ce Kit sont dynamiques - l’absorbance augmente continuellement et la coloration est relativement rapide. Il est également possible d’ajouter 250µL de HCI 1M pour terminer la réaction, prolonger le temps de détection et terminer la détection dans l’heure pour minimiser l’impact sur les résultats.
2.6Soustraire la valeur OD480 de blanc de toutes les valeurs d’absorbance et tracer la courbe standard de BSA (OD480 sur Y-axis vs. Concentration BSA sur X-axis). Calculer la concentration protéique de chaque échantillon.
Remarques :
- Une série de standards protéiques de différentes concentrations doit être dissoute et mélangée à la température ambiante avant utilisation.
- Lorsque le réactif A et le réactif B sont mélangés, une turbidité peut apparaître et disparaîtra après vortex et mélange.
- Un lecteur de microplaques avec une longueur d’onde de mesure de 480nm et une plaque à 96 puits sont nécessaires. S’il n’y a pas de lecteur de microplaques, un spectrophotomètre peut également être utilisé pour la détermination. Cependant, lors de l’utilisation d’un spectrophotomètre, les volumes de la solution A, de la solution B et de l’échantillon doivent être ajustés proportionnellement en fonction du volume de la cuve, et le nombre d’échantillons pouvant être mesurés avec chaque Kit peut être significativement réduit.
- Incuber à la température ambiante (-25°C) pendant 5 minutes avant la mesure. Si la coloration est insuffisante, le temps d’incubation peut être prolongé de manière appropriée à 10 - 15 minutes. Cependant, un temps d’incubation prolongé peut faire que l’absorbance des standards protéiques à haute concentration atteigne un plateau et ne puisse pas être utilisée pour calculer des courbes standard linéaires. Le temps et la température d’incubation doivent être bien maîtrisés.
- La méthode BCA pour déterminer la concentration protéique n’est pas affectée par la majorité des substances chimiques dans l’échantillon et peut être compatible avec jusqu’à 5% de SDS, 5% de Triton X-100, 5% de Tween 20/60/80 dans l’échantillon. La méthode BCA est affectée par les agents chélatants et des concentrations légèrement plus élevées d’agents réducteurs. Il est nécessaire de s’assurer que EDTA est en dessous de 10mM, qu’il n’y a pas d’EGTA, que le dithiothréitol est en dessous de 1mM et que β-mercaptoéthanol est en dessous de 1mM. Si l’on constate que le diluant d’échantillon ou le lysat lui-même a un fond élevé, essayez le Kit de quantification protéique Bradford (numéro de catalogue : GK10027). Vous pouvez également envisager de diluer les échantillons avec de l’eau ultrapure, de réaliser une dialyse/désalinisation ou une précipitation des protéines par ACETONE/TCA pour éliminer les substances interférentes.
- Tous les réactifs doivent être équilibrés à la température ambiante avant utilisation, et après utilisation, chaque réactif doit être immédiatement stocké selon les conditions requises par Kit de réactifs.
- Pour obtenir des résultats précis, effectuez la coloration et la mesure de l’absorbance pour les standards et les échantillons simultanément, et dessinez une courbe standard pour chaque dosage.
- Si la valeur d’absorbance à 480nm n’est pas disponible, elle peut être mesurée à la longueur d’onde comprise entre 460-500nm, mais la pente de la courbe standard et la sensibilité de détection globale seront légèrement réduites (moins de 10%).
