Ce protocole est seulement pour fournir une référence. Les conditions réelles d'application peuvent nécessiter une optimisation en fonction de vos besoins expérimentaux spécifiques.
Préparation du système lipide nanoparticule/siRNA couplé au ligand Glu-urea-Lys [1-2]:
1.Préparation des réactifs : DSPE-PEG2000-NH₂, N-hydroxysuccinimide (NHS), 1-ethyl-3-(3-diméthylaminopropyl) carbodiimide (EDC), tampon borate (0.1M, pH 8.5), sac de dialyse (MWCO 3.5kDa), siRNA, tampon acide citrique (10mM, pH 4.0),
2.Préparation du conjugué Glu-urea-Lys-DSPE-PEG2000
2.1 Activation des groupements carboxyle : Dissoudre Glu-urea-Lys (1eq), NHS (2eq), et EDC (2eq) dans DMF et agiter à la température ambiante pendant 4 heures.
2.2 Couplage DSPE-PEG2000 : Ajouter goutte à goutte le produit activé à DSPE-PEG2000-NH₂ (1.2eq) dans un tampon borate, pH 8,5, et réagir à la température de chambre en obscurité pendant 24 heures.
2.3 Purification : Placer le mélange réactionnel dans un sac de dialyse, sceller et immerger dans un tampon PBS (4°C, en obscurité, 48 heures) pour éliminer les impuretés de petites molécules, et obtenir le conjugué après lyophilisation.
2.4 Vérification : Utiliser la spectrométrie de masse MALDI-TOF pour vérifier le poids moléculaire du composé (poids moléculaire attendu : DSPE-PEG2000 + Glu-urea-Lys ≈ 2800Da + 348Da).
3. Préparation de nanoparticules lipidiques (LNP) et chargement de siRNA
3.1 Préparation de la solution lipidique : Dissoudre chaque lipide dans l'éthanol (concentration totale en lipides 10mg/mL) selon le ratio DLin-MC3-DMA (50%), cholestérol (38.5%), DSPC (10%), et Glu-urea-Lys-DSPE-PEG (1.5%), et ultrasonder dans un bain d'eau à 60°C jusqu'à dissolution complète.
3.2 Préparation de la phase aqueuse : Dissoudre siRNA dans un tampon acide citrique (0.2mg/mL).
3.3 Mélange microfluidique : Mélanger la phase lipidique et la phase aqueuse selon un ratio de débit de 3:1 (débit total 12mL/min), et collecter la sortie dans PBS (pH 7,4).
3.4 Purification par dialyse : Placer le mélange réactionnel dans un sac de dialyse, sceller et immerger dans un tampon PBS (4°C, protégé de la lumière, 48h), et changer le tampon 3 fois pendant cette période.
4. Contrôle de qualité
4.1 Taille des particules : Détection par DLS (80-100nm, PDI < 0.2).
4.2 Efficacité d'encapsulation : Méthode RiboGreen (> 95%).
4.3 Intégrité de siRNA : Electrophorèse sur gel d'agarose (pas de bandes de siRNA libres).
Remarques:
1.Opération aseptique : les expériences in vivo nécessitent une stérilisation par filtration (membrane filtrante de 0,22µm).
2.Stabilité de siRNA : LNPs doivent être stockés à -80°C après préparation pour éviter les cycle de congélation-décongélation répétés.
3?Distribution in vivo : L'imagerie de bioluminescence (comme LNP marqué à DiR) peut être complémentaire pour observer le ciblage.
References:
[1]. Lee J B, Zhang K, Tam Y Y C, et al. A Glu-urea-Lys ligand-conjugated lipid nanoparticle/siRNA system inhibits androgen receptor expression in vivo[J]. Molecular Therapy Nucleic Acids, 2016, 5.
[2]. Zhou W, Huang J, Xiao Q, et al. Glu-Urea-Lys Scaffold Functionalized Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles Targeting PSMA for In Vivo Molecular MRI of Prostate Cancer[J]. Pharmaceutics, 2022, 14(10): 2051. |
