WSP-5

Ce protocole sert uniquement de guide ; n'hésitez pas à le modifier selon vos besoins spécifiques.

1. Préparation des solutions :

(1) Préparation de la solution stock : Équilibrer la poudre de WSP-5 à température ambiante et la dissoudre dans du DMSO pour obtenir une solution stock à une concentration de 10 mM.

Remarque : La solution stock non utilisée doit être aliquotée et conservée à l'obscurité à -20°C ou -80°C pour éviter les cycles de congélation-décongélation répétés.

(2) Préparation de la solution de travail : Diluer la solution stock avec un tampon approprié (par exemple, un milieu de culture sans sérum ou du PBS) pour atteindre la concentration de travail souhaitée, généralement entre 10 et 100 μM.

Remarque : Les concentrations de travail optimales doivent être ajustées en fonction des conditions expérimentales ou des recommandations de la littérature. Les solutions de travail doivent être préparées fraîchement.

2. Détection du H₂S cellulaire à l'aide de WSP-5 [1] (à titre de référence uniquement)

(1) Traitement des cellules : Cultiver 2,5×10⁵ cellules cancéreuses 4T1 dans une plaque de 24 puits et les laisser adhérer pendant 12 heures.

(2) Incubation avec WSP-5 : Incuber les cellules avec 100 μM de sonde WSP-5 pendant 30 minutes.

(3) Traitement au Na₂S : Traiter les cellules avec 200 μM de Na₂S.

(4) Détection de la fluorescence : Après 10 minutes, acquérir des images de fluorescence à l'aide de la microscopie confocale à balayage laser (CLSM). λ ex/em = 502/525 nm.

3. Analyse des données d'intensité de fluorescence obtenues pour évaluer la sensibilité de WSP-5 au H₂S [2] (à titre de référence uniquement)

(1) Préparation expérimentale : Utiliser des plaques de 96 puits noires avec un fond transparent pour l'expérience. Préparer un volume final de 200 μL par puits.

Préparer du PBS contenant 1 mM de CTAB comme tampon pour toutes les expériences.

(2) Solubilisation de la sonde : Dissoudre la sonde WSP-5 dans du PBS contenant 1 mM de CTAB pour obtenir une concentration finale de 10 μM.

(3) Addition du donneur de H₂S : Ajouter des concentrations croissantes de Na₂S ou de DAT comme donneur de H₂S dans les puits contenant la sonde WSP-5. Les concentrations doivent varier de 0 à 10 000 μM.

(4) Mesure de la fluorescence : Mesurer l'intensité de fluorescence à des intervalles réguliers (par exemple, toutes les 30 secondes) en utilisant un lecteur de microplaques SpectraMax M5. λ ex/em = 502/525 nm.

(5) Collecte des données : Enregistrer les mesures d'intensité de fluorescence sur une période de 30 minutes.

Précautions :

Ce protocole expérimental fournit des recommandations pour la détection du H₂S cellulaire à l'aide de WSP-5 et les mesures de fluorescence qui en découlent. Des ajustements peuvent être effectués en fonction des exigences spécifiques de l'expérience.

Références :

1. He T., Qin X., Jiang C., et al. Tumor pH-responsive metastable-phase manganese sulfide nanotheranostics for traceable hydrogen sulfide gas therapy primed chemodynamic therapy [J]. Theranostics, 2020, 10(6): 2453-2462.

2. Yingzhu Zhou, Dr. Federico Mazur, et al. Sensitivity and Selectivity Analysis of Fluorescent Probes for Hydrogen Sulfide Detection [J]. Chemistry – An Asian Journal, March 1, 2022.