L-Kynurenine-d4

このプロトコールは実験のガイドに過ぎません。実際の応用は、ご自分の研究目標と機械の条件に応じて調整するべきである^[1]。

1.試薬の調製：

内部標準溶液：L-Kynurenine-d4、最終濃度は100ng/mLで、50%のメタノールに溶解される。

被験サンプル：ヒト血漿/細胞溶解液。

抽出溶媒：80%のメタノール（事前冷却、-20℃）。

2.サンプルの処理ステップ：

(1)100μLの血漿サンプルを1.5mLのEP管に入れる。

(2)10μLのL-Kynurenine-d4内在標準溶液（最終濃度は10ng/mL）を添加する。

(3)タンパク質の沈殿のために、400μLの事前冷却の80%メタノールを添加し、30秒徹底的にボルテックスする。

(4)-20℃で30分間冷蔵し、その後は13000 rpmで15分間遠心分離する。

(5)上清を清潔なEP間にピペットし、窒素で乾燥させるか、または真空遠心分離で濃縮する。

(6)100μLの20%メタノールでもう一度溶解し、ローディングの前に13000rpmで10分間遠心分離し、上清をLC-MS/MS分析に使った。

3.LC-MS/MS分析の条件：

クロマトグラフィーカラム：C18逆相カラム(2mm×100mm, 1.7μm)。

移動相：A: 0.1%のギ酸水、B: 0.1%のギ酸アセトニトリル。

勾配溶出：0-5分間、Bは2%から98%に増加する。

流量：0.3mL/分。

注射量：5μL。

MSモード：複数の反応監視。

L-Kynurenine: m/z 209→94

L-Kynurenine-d4: m/z 213→98

実験の注意事項：

1.L-Kynurenine-d4溶液は、光から避けて、-20℃で保存するべきである。使用前に調製または希釈する必要がある。

2.全ての実験操作は、ヒュームフードで行うべきであり、生物サンプルを処理する場合は、生物安全性に注意を払うべきである。

3.プロセスで、サンプルを低温で保存するべきであり、繰り返した冷凍と解凍を避け、定量の結果の正確度を確保する。

4.サンプルの各バッチを、内部標準の直線性と安定性を評価するため、ブランク対照物と品質管理サンプルを添付する必要がある。

References:
[1]. Fuertig R, Ceci A, Camus SM, et al. LC–MS/MS-based quantification of kynurenine metabolites, tryptophan, monoamines and neopterin in plasma, cerebrospinal fluid and brain. Bioanalysis. 2016 Sep 1;8(18):1903-1917.