PBFI AM

PBFI AMの使った細胞内K⁺の測定

このプロトコールはガイドラインのみを提供し、ご自分のニーズに合わせてご調整願います。

1.試薬の調製

（1）適切な量のPBFI AM固体を取り、それをDMSOに溶解し、高濃度の貯蔵液（例えば1mM）を調製する。

（2）PBS緩衝液を使い、1mM PBFI AM貯蔵液を10μM PBFI AM作業溶液に希釈した。PBFI AM作業溶液は、調製の直後に使用するべきである。

2.細胞サンプルの用意

1.5×10⁴個の細胞を96ウェルの培養プレートに接種し、完全培地（10%のウシ胎児血清を含有）で一晩中培養した。

3.PBFI AMの染色

（1）完全培地を低血清（1%）培地と交換し、45分間インキュベートする（37℃、5% CO₂）。

（2）培養培地を除去し、PBSで細胞を2-3回洗浄する。

（3）各ウェルに50μlの10μM PBFI AMを添加することで、細胞にPBFI AMをロードする。

（4）petri皿をゆっくり振盪して、染色溶液が均一に分散されているのを確かめる。

（5）100分後、PBFI AM作業溶液を吸引し廃棄し、細胞をPBSで2-3回洗浄する。

（6）適量のPBS緩衝液を添加し、細胞を浸す。

4.蛍光の検出

500nmの発光波長で測定された344と400nmの蛍光励起比を使い、K⁺の細胞内含有量を推定する。

5.注意事項

（1）PBFI AMは光に敏感的である。実験の間に、できる限り光から避けるべきである。

（2）染色時間と温度は、細胞の種類と実験の需要に応じて最適化するべきである。

（3）実験の間に、実験の条件（温度など）は厳密に管理するべきで、よって実験の結果の信憑性を確保する。

References:
[1] Andersson B, Janson V, Behnam-Motlagh P, et al. Induction of apoptosis by intracellular potassium ion depletion: using the fluorescent dye PBFI in a 96-well plate method in cultured lung cancer cells[J]. Toxicology in vitro, 2006, 20(6): 986-994.