이 프로토콜은 지침을 제공하고 필요에 따라 수정하시기 바랍니다. 아지드-알킬 클릭 화학을 통한 살아있는 세포에서 비자연 아미노산 표시[1].
1. 세포 재배양:
전염 24시간 전에 HEK293T 세포가 포리-라이신 도포된 18mm 유리 커버슬에 재배양되었고 세포 재배양 매체가 0.65mM 4-Azido-L-phenylalanine (p-Azidophenylalanine)이 보충된 성장 매체로 변경되었습니다.
2.전염 실험
pIRE4-Azi 플라스미드 (1:1 w/w)가 Lipofectamine 3000 재료를 사용하여 세포로 전염되었습니다. 24시간 후 0.65mM 4-Azido-L-phenylalanine (p-Azidophenylalanine)이 포함된 성장 매체로 세포의 성장 매체를 새로 고쳐, 세포를 추가로 24시간 (총 48시간 표현) 재배양했습니다. 표시하기 전 30분 전에 4-Azido-L-phenylalanine 보충된 성장 매체를 제거하고 세포를 128mM NaCl, 2mM KCl, 2.5mM CaCl2, 1.2mM MgCl2, 10mM 사쿠로즈, 10mM HEPES, pH7.4를 포함한 세포 외 완충 용액으로 두 번 세척했습니다. 그리고 4-Azido-L-phenylalanine이 없는 성장 매체에서 유지되었습니다.
3.아지드-알킬 클릭 화학을 통한 살아있는 세포에서 비자연 아미노산 표시
3.1 재고 용액 준비
Sulfo-Cyanine3.5 알킬 (카탈로그 번호: GC59209) 알킬 염료는 DMSO에 10mM로 혼합, BTTES (클릭 화학 도구) 50mM, 황산 구리 (카탈로그 번호: GB57835) 20mM, 아미노 가이드 (카탈로그 번호: GC15727) 100mM, 그리고 (+)-나트륨 L-아스코르바트 (카탈로그 번호: GC13616) 100mM을 초경 증류수에 혼합합니다.
3.2 클릭 화학 반응
A: 656µl의 엑소시토 버퍼 용액에 Cy3.5를 20µM의 최종 농도로 혼합합니다. 신선한 구리 황산 용액과 BTTES (1:5몰 비율) 용액을 사전 혼합한 후 150µM의 최종 농도로 추가합니다. 다음으로 아미노 가이드를 최종 농도로 추가합니다. 총 표시량은 0.7mL입니다;
B: 완성된 표시 혼합물을 4°C에서 8분간 발효한 후 실온에서 2분간 발효하고 어둠에서 처리한 후 세포에 추가합니다. 표시 혼합물을 추가하기 전에 세포를 세척합니다. 표시하는 동안 세포를 37°C와 5% CO2의 어둠에서 10-15분간 유지합니다. 표시 후 엑소시토 버퍼 용액으로 세포를 두 번 세척합니다. Cy3.5 표시된 제품은 공초점 현미경을 사용하여 591/604nm에서 관찰할 수 있습니다.
References:
[1].Schamber M R, Vafabakhsh R. Mechanism of sensitivity modulation in the calcium-sensing receptor via electrostatic tuning[J]. Nature communications, 2022, 13(1): 2194. |
