CFDA-SE

1.염색 용액의 조제

(1) 원액의 조제: CFDA-SE를 DMSO에 녹여 보통 10mM 농도의 모액을 만듭니다. 모액은 소분해서 -20°C 또는 -80°C에서 빛을 차단하고 보관하는 것이 권장됩니다. 반복적인 동결-해동은 피하도록 합니다.

(2) 작업 용액의 조제: 모액을 무혈청 배앵지 또는 PBS로 희석해서 1-10μM의 작업 용액을 조제합니다. CFDA-SE는 수용액에서 빠르게 가수분해되므로 작업 용액은 사용 직전에 조제해야 합니다. 혈청 및 배양지에 포함된 단백질은 CFDA-SE와 결합을 경쟁해서 표지 효율을 현저하게 떨어뜨립니다. 게다가 작업 용액 조제 및 표지 과정은 반드시 무혈청 조건에서 엄격하게 수행해야 합니다.

2. 부유 세포 염색

(1) 세포 수집: 4℃에서 1000×g으로 3-5분 동안 원심분리한 후 상청액을 버리고37℃로 예열한 무혈청 PBS로 세포를 2회 세척합니다 (각 5분).

(2) 세포 밀도 조절: 무혈청 PBS에 세포를 재부유시킨 후 밀도를 1×10⁶-1×10⁷ 세포/mL로 조절합니다.

(3) 염색: CFDA-SE 작업 용액을 첨가하고(최종 농도가 작업 농도에 도달하도록 함) 빠르고 부드럽게 혼합합니다.

(4) 배양: 세포 소생된 용액을 37℃에서 암조건 (빛을 차단한 상태)으로 10-30분 동안 배양합니다. 최적의 배양 시간은 세포 종류에 따라 다르고 특정 실험 요구사항에 따라 경험적으로 결정해야 합니다.

(5) 세척 및 재소생시킴: 배양 후 1000×g으로 5분 동안 원심분리해서 상청액을 버리고 잔류하는 유리 염료를 제거하기 위해 PBS로 2회 세척합니다 (각 5분).

3. 부착 세포의 염색 (부유 세포 표지법)

(1) 세포 수집: 배양지를 제거하고 PBS로 세포를 2회 세척한 후 트립신을 사용해서 세포를 탈리시킵니다. 소화 후 1000×g으로 3-5분 동안 원심분리합니다.

(2) "부유 세포의 염색"의 (2)~(5)단계에 따라 진행합니다.

4. 부착 세포의 염색 (현장 표지법)

(1) 배양: 세포를 판에 배양해서 약 60%-80%의 융합도에 도달할 때 까지 배양합니다.

(2) 세척: 기존 배양지를 제거하고 37℃로 예열한 무혈청 PBS로 세포를 2회 세척합니다.

(3) 배양: 실험 요구사항에 따라 CFDA-SE 작업 용액을 세포가 충분하게 덮일 정도로만 첨가합니다. 37℃에서 암조건 (빛을 차단한 상태)으로 10-30분 동안 배양합니다. 최적의 배양 시간은 세포 종류에 따라 다르므로 경험적으로 결정해야 합니다.

(4) 세척: 염색 작업 용액을 흡인해서 제거한 후 PBS로 세포를 2회 세척합니다.

5. 검출

실험 목적에 따라 필요 시 세포를 분리시킨 후 여기/방출 (Ex/Em) 파장 488/518nm 조건에서 형광 현미경으로 관찰하거나 유세포 분석기로 분석합니다.

주의 사항:

(1) 세포 내 에스테라 활성은 세포 종류에 따라 다르므로 염색 효율에 차이가 발생할 수 있습니다.

(2) 형광 염료는 광표백에 취약합니다. 염색 절차 전반에 걸쳐 반드시 빛을 차단해서 보호해야 합니다.