Cy3-cholesterol (Synonyms: Cyanine3-Cholesterol; Cy3-CLS)

주의: Cy3-cholesterol 흡수는 다양한 세포에서 구체적인 사용 방법이 크게 다릅니다.

1.특정 세포의 경우 문헌을 참조하거나 검출 결과에 따라 조정하고 최적화하십시오.

Cy3-cholesterol 흡수 작업 용액의 제조.

1.1 개봉 전에 제품을 실온에서 균형 상태로 만든 후 짧게 원심분리하고 Cy3-cholesterol을 무수 에탄올에 녹여 농도를 10mM로 만듭니다.

1.2 96과 6웰 판의 경우에 각각 매웰에 100μl과 1ml의 Cy3-cholesterol 흡수 작업 용액(워킹 용액)이 필요합니다. 다른 배양 용기의 경우에 용량은 비례적으로 조정할 수 있습니다. 시료 수에 따라 필요한 콜레스테롤 흡수 작업 용액의 부피를 계산합니다. 무혈청 작업 용액을 사용해서 25μM의 Cy3-cholesterol 용액을 제조합니다.

참고 1: 다양한 세포 샘플에 대해 예비 실험을 수행해서 최적의 세포 농도를 결정하는 것이 권장됩니다. 1-25μM 범위 내의 농도 기울기를 설정하는 것이 권장됩니다.

참고 2: Cy3-cholesterol 흡수 작업 용액을 제조할 때는 빛을 피하도록 합니다. 제조된 Cy3-cholesterol 흡수 작업 용액은 한 번에 모두 사용해야 해서 동결할 수 없습니다.

2. 양성 대조 그룹 설정(선택 사항). 별도의 양성 대조 그룹 복제물을 설정하고 25μM Cy3-cholesterol과 10μM U 18666A를 포함한 작업 용액을 첨가하시기 바랍니다. U 18666A는 콜레스테롤 배출 경로를 방해해서 콜레스테롤 및 기타 스테롤이 리소좀에 축적될 수 있습니다.

참고: 대부분의 세포에서 U 18666A 처리 24시간은 세포 내 콜레스테롤의 외부 수송을 효과적으로 억제할 수 있고 세포 내에 축적된 Cy3-cholesterol은 강한 주황색 형광을 나타냅냅니다.일부 세포의 경우에 용량 및 시간 기울기를 탐색해야 합니다[1].

3. 세포 콜레스테롤 흡수의 효소 표지 분석법.

a. 배양. 세포를 96웰 블랙 마이크로플레이트에 배양합니니다. 매웰당 세포 수는 100-10,000개 범위 내에서 조절해야 하고 보통 2,000-5,000개 범위입니다. 실험 설계에 따라 세포에 일정한 처리를 수행합니다.

참고: 접종한 세포 수는 검출 시 세포 계수를 고려해야 합니다. 세포를 일정 기간 배양해야 하거나 약물 처리 시간이 상대적으로 긴 경우에 접종한 세포 수를 적절히 줄여야 합니다. 세포 수가 너무 많거나 너무 적으면 최종 검출 결과에 영향을 미칠 수 있습니다.

b. 세척. 부착 세포의 경우에 배양지를 제거하고 PBS로 세포를 한 번 세척합니다. 부유 세포의 경우에 실온에서 250-1000×g으로 5분간 원심분리하고 상층액을 제거한 후 PBS로 한 번 세척합니다.

참고: PBS로 세포를 세척할지 여부는 실험 설계에 따라 결정할 수 있습니다.

c. 콜레스테롤 흡수의 형광 표지. 적절한 부피의Cy3-cholesterol 흡수 작업 용액을 첨가하십시오. 보통 96웰 판의 각 웰에 100μl을 첨가합니다. 37°C및 어둠을 곳에서 24시간 배양합니다. 배양 시간은 12-48시간 범위 내에서 조정할 수 있습니다.

참고: 첫 번째 실험이고 배양 시간을 결정할 수 없는 경우에 먼저 37°C및 어둠을 곳에서 24시간 배양하고 형광 효과를 관찰하는 것이 권장됩니다. 정상 세포의 형광이 너무 강하면 시간을 적절히 단축하고 형광이 너무 약하면 시간을 적절히 연장하시기 바랍니다.

d. 검출. 배양 후 PBS 또는 HBSS로 1-3회 세척합니다. 형광 효소 분석기를 직접 사용해서 검출합니다(Cy3-cholesterol롤은 주황색 형광, Ex/Em = 554/568nm). 권장되는 여기 파장은 554nm, 방출 파장은 568nm이고 파장 폭은 5nm입니다. 또한 액체를 제거하고 적절한 용해액을 동량 첨가해서 세포를 용해시킨 후 형광 검출을 수행할 수도 있습니다. 대조 그룹과 처리 그룹의 RFU(상대 형광 단위)를 비교해서 처리 그룹의 콜레스테롤 흡수 능력 변화를 정량적으로 계산할 수 있습니다.

참고 1: 다양한 세포 간 콜레스테롤 흡수 능력의 현저한 차이로 인해 다양한 세포에 대한 세포 콜레스테롤 흡수 형광 효소 분석은 더 나은 검출 결과를 얻기 위해 적절히 최적화되어야 합니다. 예를 들어,Cy3-cholesterol의 농도, 검출 시 세포 수 그리고Cy3-cholesterol 흡수 작업 용액의 배양 시간을 최적화해야 할 수 있습니다. 형광 분석기의 상부 판독 또는 하부 판독 모드도 검출 결과에 일부 영향을 미칠 수 있습니다. 상부 판독 검출을 우선적으로 사용하는 것이 권장됩니다.

참고 2: 형광 효소 분석 전에 저배율 형광 현미경을 짧게 사용해서 세포의 형광 강도를 빠르게 예비 관찰하고 콜레스테롤 흡수 실험이 성공적인지 대략적으로 판단할 수도 있습니다. 고배율 관찰은 형광 소광을 일으키기 쉽고 최종 정량 결과를 방해하므로 고배율 관찰은 권장하지 않습니다.

참고 3: 처리 약물이 세포 증식에 현저한 영향을 미치는 경우에 RFU 값에 대해 세포 수량 보정을 사용하는 것이 권장됩니다.

4. 유세포 분석기를 이용한 세포 콜레스테롤 흡수 검출.

a. 배양. 실험 설계에 따라 세포를 6웰 판 또는 적절한 세포 배양 접시에 배양하고 세포에 적절한 처리를 수행합니다.

b. 세포 제조. 부착 세포는 PBS로 한 번 세척합니다; 부유 세포는 실온에서 250-1000×g으로 5분간 원심분리하고 상층액을 제거한 후 PBS로 한 번 세척합니다.

참고: PBS로 세포를 세척할지 여부는 실험 설계에 따라 결정할 수 있습니다.

c. 콜레스테롤 흡수의 형광 표지. 이전 단계에서 6웰 판에 접종한 세포의 경우에 각 공에Cy3-cholesterol 흡수 작업 용액 1ml를 첨가합니다. 이전 단계에서 부유액에서 침전된 1×106개 세포의 경우에 Cy3-cholesterol 흡수 작업 용액 1ml를 첨가하고 단일 세포 부유액을 형성하도록 소생시킵니다. 37°C및 어둠을 곳에서 24시간 배양해야 합니다. 배양 시간은 12-48시간 범위 내에서 조정할 수 있습니다.

참고: 첫 번째 실험이고 배양 시간을 결정할 수 없는 경우에 먼저 37°C및 어둠을 곳에서 24시간 배양하고 형광 효과를 관찰하는 것이 권장됩니다. 정상 세포의 형광이 너무 강하면 시간을 적절히 단축하고 형광이 너무 약하면 시간을 적절히 연장하시기바랍니다.

d. 검출 방법. 배양이 완료된 후 PBS 또는 HBSS로 부착 세포를 한 번 세척한 트립신으로 세포를 소화시킨 후 다시 한 번 세척하고 유세포 분석기 검출에 사용할 수 있습니다.부유 세포의 경우에 PBS 또는 HBSS로 1-3회 세척하고 직접 유세포 분석기 검출을 수행합니다. 유세포 분석기로 세포 부유액을 검출합니다.Cy3-cholesterol은 주황색 형광이고 Ex/Em = 554/568nm입니다. 유세포 분석기의 경우에 CY3/PE 채널을 사용해서 검출하는 것이 권장됩니다.

참고 1: 다양한 세포 간 콜레스테롤 흡수 능력의 현저한 차이로 인해 다양한 세포에 대한 콜레스테롤 흡수 유세포 분석기 검출은 더 나은 검출 결과를 얻기 위해 적절히 최적화되어야 합니다. 예를 들어Cy3-cholesterol의 농도와 세포 수 등이 있습니다.

참고 2: 유세포 분석기의 민감도로 인해 사용된 형광 탐침의 농도는 형광 현미경 검출보다 낮을 수 있습니다. 이 경우 세포 유형과 시약 염색 조건에 따라Cy3-cholesterol의 희석 배수를 적절히 조정할 수 있습니다.

5. 형광 현미경을 이용한 세포 콜레스테롤 흡수 검출.

a. 배양. 세포를 96웰 판, 세포 배양 접시 또는 세포 슬라이드에 배양하고 실험 설계에 따라 적절히 처리합니다.

b. 세척. 부착 세포의 경우에 배지를 제거하고 PBS로 세포를 한 번 세척합니다. 부유 세포의 경우에 실온에서 250-1000×g으로 5분간 원심분리하고 상층액을 제거한 후 PBS로 한 번 세척합니다.

참고: PBS로 세포를 세척할지 여부는 실험 설계에 따라 직접 결정할 수 있습니다.

c. 콜레스테롤 흡수의 형광 표지. 적절한 부피의 Cy3-cholesterol롤 흡수 작업 용액을 첨가하합니다. 보통 96웰 판의 각 웰에 100μl, 24웰 판의 각 웰에 250μl, 12웰 판의 각 웰에 500μl그리고 6웰 판의 각 웰에 1ml를 첨가합니다. 37°C 및 어둠을 곳에서 24시간 배양합니다. 배양 시간은 12-48시간 범위 내에서 조정할 수 있습니다.

참고: 첫 번째 실험이고 배양 시간을 결정할 수 없는 경우에 먼저 37°C및 어둠을 곳에서 24시간 배양하고 형광 효과를 관찰하는 것이 권장됩니다. 정상 세포의 형광이 너무 강하면 시간을 적절히 단축하고 형광이 너무 약하면 시간을 적절히 연장하시기 바랍니다.

d. 검출. 배양 후 PBS 또는 HBSS로 1-3회 세척하고 형광 현미경 하에서 콜레스테롤 흡수 효과를 관찰합니다(Cy3-cholesterol롤은 주황색 형광, Ex/Em = 554/568nm).

References:
[1]. Chen, Lifeng, et al. "Cholesterol-rich lysosomes induced by respiratory syncytial virus promote viral replication by blocking autophagy flux." Nature Communications 15.1 (2024): 6311.