Cy5-DBCO

Cy5-DBCO 세포 표지 및 추적 방법^[1]

본 프로토콜은 연구 데이터에서 게조되었고 참고용으로만 제공됩니다. 특정 실험 요구사항에 따라 조정하시기 바랍니다.

1.시약 준비: 테트라아세틸화된 N-azidoacetyl-D-mannosamine (Ac4ManNAz)을 완전 세포 배양액에 용해하고 50μM 작업 용액을 조제합니다. Cy5-DBCO를 적절한 완충액(DPBS, pH=7.4)에 용해해서 작업 농도(시험관 내 실험용 20μM, 생체 내 주사용 25μM)를 조제합니다.

2.표적 세포 아지드 표지: 적절한 밀도로 표적 세포를 접종하고 50μM Ac4ManNAz가 함유된 완전 배양액에서 3일간 배양해서 대사적 경로를 통해 세포 표면에 아지드 기를 도입합니다.

3.Cy5-DBCO 표지 및 검출(체외 실험): Ac4ManNAz 처리 세포를 DPBS(pH=7.4)로 두 번 세척합니다. Cy5-DBCO 작업용액(20μM)을 첨가해서 37°C에서 1시간 배양합니다. DPBS로 세포를 철저하게 세척해서 결합하지 않은 탐침을 제거합니다. 이후 세포를 고정 (포름알데히드-글루타랄데히드 고정액 사용), 핵을 염색 (DAPI 사용)하고 공초점 레이저 주사 현미경을 이용하여 형광 영상 분석을 수행합니다(Ex=635nm, Em=650-700nm). 정량 분석은 유세포 분석법을 이용해서 수행할 수도 있습니다.

4.Cy5-DBCO 표지 및 검출(체내 실험): Ac4ManNAz로 3일간 처리한 표적 세포를 살아있는 동물의 표적 장기에 직접 주사합니다. 세포 이식 3일 후 꼬리 정맥을 통해 쥐에 Cy5-DBCO 용액(25μM, 200μL)을 주사합니다. 탐침 주사 4시간 후 생체 내 영상 시스템을 이용해서 전신 형광 영상을 촬영하고 표적 장기의 특이적 신호를 관찰합니다. 또는 장기를 해부해서 형광 영상 작업대를 이용한 생체 외 영상을 수행하거나 동결 절편을 제작해서 현미경 관찰을 할 수 있습니다.

주의 사항:

(1) 반응하지 않은 유리 Cy5-DBCO는 주사 후 4시간 내에 주로 신장 경로를 통해 배출되고 배경 신호를 감소시키기 위해 도움이 됩니다.

(2) 안전과 건강을 위해 작업할 때 실험복과 일회용 장갑을 착용하시기 바랍니다.

References:
[1] Kang SW, Lee S, Na JH, et al. Cell labeling and tracking method without distorted signals by phagocytosis of macrophages. Theranostics. 2014 Feb 12;4(4):420-31.