Mag-Fura-2 AM을 사용한 칼슘 함량 평가[1]
이 프로토콜은 지침만 제공하고 특정 요구 사항에 따라 수정하시기 바랍니다.
1.염색액 준비
(1) 원액 준비: 고품질 무수 DMSO에서 농도 1-10mM의 Mag-Fura-2 AM 원액을 준비합니다.
주의: 사용하지 않은 원액을 소분해서 -20°C 또는 -80°C에서 암소 보관하고 반복적인 동결 및 해동을 피하도록 합니다.
(2) 작업 용액 준비: 적절한 완충액(예: 혈청 및 페놀 레드 무 배양지 또는 PBS)으로 원액을 희석해서 농도 1-10μM의 작업액을 준비합니다. 실제 상황에 따라 작업 용액 농도를 조절하고 반복적인 동결 및 해동을 피하기 위해 즉시 준비합니다.
주의: 작업 용액은 실험 당일 신선하게 준비해야 합니다. 사용 전에 Mag-Fura-2 AM 용액은 다시 가열한 후 원심분리해야 합니다.
2.세포 소생된 용액 염색
(1) 소생된 세포: 4°C 및 1000g에서 3-5분 원심분리 후 상청액을 폐기하고 PBS 또는 기타 완충액으로 각각 5분씩 두 번 세척합니다.
(2) 부착 세포: PBS 또는 기타 완충액으로 두 번 세척하고 트립신을 첨가해서 세포를 소화시킨 후 소화가 완료되면 1000g에서 3-5분 원심분리합니다;
(3) 세포를 필요한 온도(25°C-37°C)에서 10분 동안 배양해서 이온 농도 기울기가 안정 및 평형 상태에 도달하도록 합니다. Mag-Fura-2 AM 원액 4μl과 20% Pluronic® F-127 5μl을 취해서 1ml 세포 배양지에 첨가하고 와류 혼합해서 균질한 프로브 분산액을 얻습니다. 준비된 프로브 분산액 250μl을 취해서 세포가 포함된 배양지 750μl에 첨가하고 잘 혼합합니다. 이 시점에서 초기 모액 농도를 기준으로 최종 농도 1-5μM의 작업 용액이 얻어집니다. 필요에 따라 프로브를 15-60분 동안 배양합니다. 세포를 3회 세척한 후 세포 내 프로브가 완전히 탈에스터화되도록 30분 동안 추가 배양을 계속합니다.
참고:
1)대부분의 세포에서 Mag-Fura-2 AM의 권장 작업 농도는 1-5μM이고 구체적인 농도는 실험 요구 사항에 따라 최적화해야 합니다. 과부하로 인한 세포 독성을 피하기 위해 유효한 결과를 얻는 기반 하에 가능한 한 낮은 프로브 농도를 사용합니다;
2)(선택 사항) 세포에 유기 음이온 수송체가 포함된 경우에 세포 배양지에 프로베네시드 (1-2.5mM) 또는 설핀피라존 (0.1-0.25mM)을 첨가해야 할 수 있습니다. 탈에스터화 프로브의 누출 수준을 낮추기 위함입니다. 프로베네시드 또는 설핀피라존의 원액은 알칼리성으로 배양지 첨가 후 pH를 재조정해야 합니다;
3)혈청 함유 배양지를 사용하는 경우에 혈청 락토나아제가 Mag-Fura-2 AM을 분해해서 염료 적재 효과를 감소시킵니다; 반면 페놀 레드 함유 배지는 배경값을 약간 높게 만듭니다. 염색 작업 용액을 첨가하기 전에 세포를 2-3회 세척합니다;
4)프로브 적재 온도를 낮추면 프로브의 구획화가 감소할 수 있습니다.
(4) 적절한 장비를 선택하고 형광 측정을 수행합니다(Ex/Em=336/503nm).
3.세포 부착 염색
(1) 무균 입체 현미경에 부착 세포를 배양합니다;
(2) 배양 배지에서 입체 현미경을 제거하고 과도한 배양 배지를 흡인한 후 입체 현미경을 습한 환경에 배치합니다;
(3) 세포를 필요한 온도 (25°C-37°C)에서 10분 동안 배양해서 이온 농도 기울기가 안정 및 평형 상태에 도달하도록 합니다. Mag-Fura-2 AM 원액 4μl과 20% Pluronic® F-127 5μl을 취해서 1ml 세포 배양지에 첨가하고 와류 혼합해서 균질한 프로브 분산액을 얻습니다. 준비된 프로브 분산액 250μl을 취해서 세포가 포함된 배양지 750μl에 첨가하고 잘 혼합합니다. 이 시점에서 초기 모액 농도를 기준으로 최종 농도 1-5μM의 작업 용액이 얻어집니다. 요구 사항에 따라 프로브를 15-60분 동안 배양합니다. 세포를 3회 세척한 후 세포 내 프로브가 완전히 탈에스터화되도록 30분 동안 추가 배양을 계속합니다.
(4) 적절한 기기를 선택하고 형광 측정을 수행합니다(Ex/Em=336/503nm).
4.주의 사항:
(1) 형광 염료 모두 광해체 현상이 발생할 수 있습니다. 형광의 광해체를 늦추기 위해 가능한 한 빛을 피하도록 합니다.
(2) 안전과 건강을 위해 조작할 때 실험복과 일회용 장갑을 착용합니다.
(3) Mag-Fura-2 AM은 실험 전 과정에서 암소 보관해야 합니다.
(4) 이 프로토콜 및 모든 시약은 과학 연구용으로만 사용합니다.
References:
[1] Gurney A M, Drummond R M, Fay F S. Calcium signalling in sarcoplasmic reticulum, cytoplasm and mitochondria during activation of rabbit aorta myocytes[J]. Cell Calcium, 2000, 27(6): 339-351. |
