1.개요
RiboGreen의 RNA 정량 검출에서 완전한 선형 동적 범위를 얻기 위해 두 가지 다른 염료 농도가 필요합니다. RiboGreen 작업 용액을 준비하기 전(이하 시약 준비 참조)에는 고범위 검사(20ng/mL-500ng/mL RNA), 저범위 검사(1ng/mL-50ng/mL RNA) 또는 두 범위 다 수행할지 결정해야 합니다.
2. 시약 준비
실험 당일, RiboGreen의 수용성 작업 용액은 무균 일회용 폴리프로필렌 플라스틱 튜브에서 준비되었습니다. RiboGreen이 유리 표면에 부착될 수 있고 유리 제품을 사용하지 마십시오. 준비된 RiboGreen 작업 용액은 빛을 피해서 보관해야 합니다. 작업 용액은 준비 후 몇 시간 내에 사용하는 것이 가장 좋고 장기간 보관하지 마십시오.
3. RNA 표준 곡선 준비
표준 곡선을 위해 상업용 RNA 표준품을 사용할 수 있습니다. 예를 들어 일반적으로 사용되는 16S와 23S 리보솜 RNA가 있습니다. 또는 다른 순수한 RNA 제품도 사용할 수 있습니다. 때로는 시험할 시료과 유사한 RNA 표준품을 사용해서 표준 곡선을 작성하는 것이 좋습니다. 일반적으로 대부분의 단일 염기 RNA 분자는 거의 동일한 형광 신호를 생성할 수 있습니다. 핵산 시약을 오염시키는 일반적인 화합물(뉴클레오사이드, 염화물, 유레아, 에탄올, 클로로폼, 세제, 단백질, 아가로즈 등)이 존재하더라도 RiboGreen의 검출 결과는 여전히 좋은 선형 관계를 유지할 수 있고 형광 강도는 영향을 받을 수 있습니다. 효과적인 제어를 보장하기 위해 표준 곡선을 준비하는데 사용된 RNA 용액은 시험할 시료과 일치해야 하고 오염물질의 수준이 유사하도록 보장할 수 있습니다.
3.1 1xTE 버퍼를 사용해서 플라스틱 병에 2㎍/㎖ RNA 용액을 준비합니다. 1cm 길이의 광로를 가진 분광광도계 측정 컵으로 RNA 용액의 기본 흡광도를 260nm (A260)에서 측정합니다. A260=0.05는 RNA A의 농도가 2㎍/㎖에 해당합니다.
3.2 고범위 표준 곡선을 준비할 때 일회용 핵산 효소 플라스틱 튜브에 2㎍/㎖ RNA 용액을 희석해서 최종 농도의 2배 시리즈 RNA 표준 용액을 준비하고 마지막으로 분광 광도계 측정 컵 또는 배양 접시로 옮깁니다.
3.3 저범위 표준 곡선을 준비할 때 일회용 핵산효소 플라스틱 튜브에 2㎍/㎖ RNA 용액을 희석해서 최종 농도의 2배 시리즈 RNA 표준 용액을 준비하고 마지막으로 분광 광도계 측정 컵 또는 배양 접시로 옮깁니다.
3.4 RiboGreen 시약 작업 용액(2-시약 준비 참조)과 2배 농도의 RNA 표준 용액을 동일한 부피로 혼합합니다. 실온에서 어두운 곳에서 2-5분간 배양하고 측정 용기로 충분한 부피의 측정 용액을 넣어야 합니다. 10×10㎜의 분광 광도계 측정 컵의 경우 2㎖ 이상이어야 합니다. 96웰 판의 각 웰의 경우 200㎕ 이하로는 낮추지 마십시오.
3.5 형광 분광 광도계나 형광 효소 연계 면역 흡착 분석 (ELISA) 판독기를 사용해서 시료의 형광 값을 측정하고 표준 형광 파장을 선택합니다(흥분~480nm, 방출~520nm).
3.6 각 시료의 형광 값을 공백 형광 값에서 빼십시오. 이 후에 보정된 형광 값을 y축으로 RNA 농도를 x축으로 하여 표준 곡선을 작성합니다.
4. 시료 분석
4.1 1xTE 버퍼를 사용해서 시료을 적절한 부피로 희석합니다(예를 들어, 10×10㎜ 분광 광도계 측정 컵에는 1.0㎖, 96웰 마이크로 판에는 100㎕). 각 시험할 시료에 대해 여러 희석 계수를 하는 것이 좋습니다. 시험 시료의 희석 계수가 높을수록 특정 오염물질의 간섭을 줄이는데 도움이 됩니다. 그런데 너무 작은 시료 부피는 측정하기 어렵기 때문에 피해야 합니다. 게다가 동일한 실험에서 오염물질 수준을 가능한 한 일관되게 유지해서 오염물질로 인한 시료 간 신호 차이를 줄이는 것이 중요합니다. 예를 들어 RNA 시료 시리즈의 염화물 농도가 크게 다르다면 단순한 표준 곡선을 사용해서 비교할 수 없습니다. 이러한 문제를 방지하기 위해 가능하면 모든 시료의 오염물질 농도를 동일한 수준으로 조정해야 합니다. (5-시료 내 DNA 제거 참조)
4.2 각 시료에 RiboGreen 측정 시약 (2-시약 준비 참조)을 동일한 부피로 추가하고 실온에서 어두운 곳에서 2-5분간 배양합니다.
4.3 표준 곡선 측정과 동일한 기기 파라미터를 선택해서 시료의 형광 값을 측정합니다. 광표백 효과를 줄이기 위해 모든 시료의 형광 측정 시간은 변하지 않습니다.
4.4 각 시료의 형광 값을 공백 형광 값에서 빼십시오. 생성된 RNA 표준 곡선을 기준으로 시료의 RNA 농도를 결정합니다. 가능하면 다른 시료을 희석하고 측정을 반복해서 정량 결과를 확인합니다.
5. 시료 내 DNA 정리
RiboGreen은 DNA에도 결합할 수 있고 RNA가 없는 DNases를 사용해서 먼저 시료에서 DNA를 제거해서 DNA와 RiboGreen의 결합으로 인한 형광 간섭을 피할 수 있고 시료 내 모든 형광이 RiboGreen과 RNA의 결합에서 유래함을 보장할 수 있습니다.
5.1 준비 10x DNase 소화 버퍼:핵산 효소 없이 200mM Tris HCl, pH 7.5,100 mM MgCl2,20 mM CaCl2.
5.2시료를 포함한 각 DNA에 10xDNase 소화 완충제 부피의 0.11배를 첨가합니다.(예:시료이 9mL 라면 10x buffer 1mL를 넣습니다).
5. 3~5 단위의 RNase 없이 데 옥시 리보핵산 분해효소 i를 추가 DNA의 1 μg입니다.
5.4 37 ° C에서 90분간 배양합니다.
5.5 1xTE 버퍼를 사용해서 시료을 최소한 10배 희석하고 소화액 중 잔류 염화물 이온이 RiboGreen 측정에 미치는 간섭을 줄입니다.
5.6 위의 단계에 따라 RiboGreen 실험을 수행합니다.
