Cy5 NHS ester

Etiquetado del Cy5 NHS ester del anticuerpo policlonal anti-GST^[1-2]

Este protocolo experimental es solo para referencia. Por favor, ajuste de acuerdo con las necesidades reales. 

(1) Preparación de Cy5 NHS ester: Preparar solución de éster Cy5 NHS ester (MW=761.84) a una concentración de 10mg/mL en DMSO.

(2) Cálculo de la cantidad de tinte: La cantidad requerida de tinte se calcula en función de la masa de la proteína a etiquetar, la masa molar de la proteína y el tinte, y el factor de exceso molar recomendado. Se recomienda un exceso molar de 8 veces de éster del NHS para lograr un solo etiquetado. La fórmula decálculo es: cantidad deNHS ester (mg) = 8 x masa compuesta (mg) x masa molar de NHS ester (Da) / masa molar compuesta (Da). Por ejemplo, cuando se utiliza el Cy5 NHS ester (masa molar 761.84Da) para etiquetar 3mg anti-GST (masa molar 150kDa), la masa requerida de Cy5 NHS ester es 8 x 3mg x 761.84Da / 150kDa = 0.122mg.

(3) Preparación de anticuerpos Anti-GST: Diálisis de anticuerpos anti-GST (concentración de 0.5mL a 3mg/mL) contra 1L de solución de 0.15M NaCl a temperatura ambiente durante 4 horas. Diálisis de nuevo contra 1L de solución fresca de 0.15M NaCl a 4°C durante la noche. Al día siguiente, diálisis contra 1L de 0.1M NaHCO₃ (pH=8.3) durante 4 horas. Filtre la solución de anticuerpos  a través de un filtro de jeringa de 0.22μm. Doluir una pequeña cantidad de anticuerpos con 0.1M de NaHCO3 y medir la absorción UV a 280nm para calcular la cantidad total de anticuerpos marcados (coeficiente de extinción molar de anticuerpos IgG 170000M^-1cm^-1 a 280nm).

(4) Etiquetado: Agregue la solución de Cy5 NHS ester a la solución de anticuerpos gradualmente en pequeñas alícuotas mientras revuelve suavemente. Proteja la reacción de la luz e incube con agitación continua a temperatura ambiente durante 45 minutos o a 4°Cdurante 4 horars.

(5) Purificación de proteínas: Diálisis contrat 1L de solución de 0.15M NaCl a temperatura ambiente bajo protección contra la luz durante 4 horas para eliminar el Cy5 NHS ester sin etiquetar. Dialice de nuevo contra 1L de solución fresca de 0.15M NaCl de 4°C bajo protección contra la luz durante la noche. Dialice contra 1L de 0.01M PBS / 0.01% de solución de azida de sodio a temperatura ambiente bajo protección contra la luz durante 4 horas, luego dialice nuevamente a 4°C bajo protección contra la luz durante la noche. Filtre la solución de anticuerpos a través de un filtro de jeringa de 0.22μm. Diluir la solución de anticuerpos marcado por un múltiplo entero con 0.01M PBS / 0.01% de azida de sodio y medir la absorbancia UV-Vis a 280nm (protein) y 650nm (Cy).

(6) CálculoF/P: El coeficiente de extinción molar de Cy5 a 650nm es de 250000M^-1cm^-1. El coeficiente de extinción molar de la proteína a 280nm es 170000M^-1cm^-1. La absorción de Cy5 a 280nm es el 5% de la de 650nm. Calcule el valor F/P usando la sigueinte fórmula:

[Tinte Cy5] = (A₆₅₀)/250000

[péptido] = [A₂₈₀ - (0.05×A₆₅₀)]/170000

F/Pfinal = [tinte]/[péptido] = {0.68×A₆₅₀} / {A₂₈₀ - (0.05×A₆₅₀)}

Precauciones:

(1) La estabilidad de las proteínas marcadas con CyDye depende de la propia proteína. Por ejemplo, la IgG etiquetada se puede almacenar a 4°C bajo protección contra la luz durante 2 mese. Para un almacenamiento más largo, agregue un volumen igual de glicerol y almacene a -20°C bajo protección contra la luz.

(2) Cy5 NHS ester debe estar recién preparado antes de su uso. La solución de stock DMSO se puede almacenar brevemente a -20℃ protegida de la luz. Se recomienda una preparación fresca para garantizar la actividad.

(3) Evite estrictamente la exposición a la luz durante todo el proceso de etiquetado para evitar el fotoblandeamiento del tinte fluorescente.

(4) Por seguridad y salud, por favor use una bata de laboratorio y guantes desechables durante la operación.