Este protocolo solo proporciona una guía y debe modificarse según sus necesidades.
Preparación de nanopartículas lipídicas de MC3
Tomando como ejemplo una terapia aprobada por la FDA basada en ARNi dirigida al ARNm de transtiretina (TTR), la proporción molar de lípidos de las LNP utilizadas es de 50:10:38.5:1.5 para D-Lin-MC3-DMA (Número de catálogo: GC35879): DSPC (Número de catálogo: GC41832): colesterol (Número de catálogo: GC17398): PEG2000-C-DMG (Número de catálogo: GC63813). Además, la proporción en peso de ARN a lípido se especifica en 0.05 (peso/peso).
A. Preparación de la mezcla de lípidos:
1. Disolver los lípidos en etanol para crear soluciones de reserva de 10 mg/mL. Almacenar estas soluciones a -20°C para su uso posterior.
2. Preparar la mezcla de lípidos añadiendo a cada mL: 548 µL de D-Lin-MC3-DMA (10 mg/mL), 254 µL de colesterol (10 mg/mL), 134 µL de DSPC (10 mg/mL) y 64 µL de PEG2000-C-DMG. Mezclar completamente para obtener una solución clara. El contenido total de lípidos por mL es de 10 mg.
Nota:
a. El colesterol en solución debe mantenerse caliente (>37°C) para mantener su fluidez. Transferir la solución de colesterol rápidamente para evitar el enfriamiento;
b. El lípido ionizable generalmente es un líquido. Debido a su viscosidad, siempre debe pesarse en lugar de depender del volumen de la pipeta automática.
c. La elección de los lípidos y las proporciones puede modificarse según se desee, lo que afectará las propiedades de las LNP (tamaño, polidispersidad y eficacia) y la cantidad de ARNm requerida.
B. Preparación del ARNi:
1. Preparar una solución de ARNi a 166.7 µg/mL utilizando un tampón de acetato de sodio a 100 mM y pH 5.
Nota: La eficiencia de encapsulación se ve influenciada por la proporción en peso de lípido a ARNi. Se pueden preparar formulaciones alternativas con diferentes proporciones, lo que requiere ajustes por parte del usuario.
C. Mezcla:
1. Existen tres métodos comúnmente utilizados para lograr una mezcla rápida de las soluciones: el método de mezcla con pipeta, el método de mezcla por vórtex y el método de mezcla por microfluidos. Todos estos métodos de mezcla pueden usarse para diversas aplicaciones.
Nota: La mezcla con pipeta y la mezcla por vórtex pueden dar lugar a nanopartículas lipídicas (LNP) heterogéneas con menor encapsulación, lo que las hace propensas a la variabilidad. Los microfluidos ofrecen una mezcla precisa y reproducible para LNP homogéneas y una alta encapsulación. Los lípidos en etanol se mezclan con la solución acuosa en flujos individuales, formando LNP al mezclarse, que se recogen en un solo tubo.
1. Método de mezcla con pipeta:
1.1 Pipetear 3 mL de solución de ARNi en 1 mL de mezcla de lípidos (relación 1:3). Mezclar vigorosamente durante 20-30 segundos.
1.2 Incubar la solución resultante a temperatura ambiente durante hasta 15 minutos.
1.3 Después de la mezcla, las LNP se dializan contra PBS (pH 7.4) durante 2 horas, se filtran estérilmente utilizando filtros de 0.2 μm y se almacenan a 4°C.
2. Método de mezcla por vórtex:
2.1 Vortexar 3 mL de solución de ARNi a una velocidad moderada en el mezclador de vórtex. Luego, agregar rápidamente 1 mL de la solución de mezcla de lípidos a la solución vortexada (se utiliza generalmente una relación 1:3 de la mezcla de lípidos en etanol a tampón acuoso). Continuar vortexando la dispersión resultante durante otros 20-30 segundos.
2.2 Incubar la solución a temperatura ambiente durante hasta 15 minutos.
2.3 Dializar las LNP en PBS (pH 7.4) durante 2 horas, filtrar con filtros de 0.2 µm y almacenar a 4°C.
3. Método de mezcla por microfluidos:
3.1 En un dispositivo microfluídico, mezclar 3 mL de tampón de ARNi con 1 mL de mezcla de lípidos (relación 1:3) a una velocidad de flujo total de 12 mL/min.
3.2 Después de la mezcla, las LNP se dializan contra PBS (pH 7.4) durante 2 horas, se filtran estérilmente utilizando filtros de 0.2 μm y se almacenan a 4°C.
Nota: Los parámetros como la proporción de flujo y el flujo total pueden ajustarse para optimizar las LNP.
Referencias:
[1] Mashima R, Takada S. Lipid Nanoparticles: A Novel Gene Delivery Technique for Clinical Application. Curr Issues Mol Biol. 2022 Oct 19;44(10):5013-5027.
[2] McKenzie RE, Minnell JJ, Ganley M, Painter GF, Draper SL. mRNA Synthesis and Encapsulation in Ionizable Lipid Nanoparticles. Curr Protoc. 2023 Sep;3(9):e898.
