Cy5.5 NHS ester (non-sulfonated)

Cy5.5-NHS-ester-markierter polyklonaler Anti-GST-Antikörper^[1-2]

Dieses Versuchsprotokoll dient nur als Referenz. Bitte entsprechend den tatsächlichen Bedürfnissen ändern.

(1) Herstellung von Cy5.5-NHS-ester-Lösung: Cy5.5 NHS ester(MW=716.31) in DNMSO lösen. Die Konzentration beträgt 10mg/mL.

(2) Berechnung der Farbstoffmenge: Die benötigte Farbstoffmenge für die Reaktion berechnen. Dazu die Masse des zu markierenden Proteins, die molaren Massen von Proteinen und Farbstoff sowie den empfohlenen molaren Überschuss nutzen. Für eine Einfachmarkierung wird ein 8-facher molarer Überschuss von NHS ester empfohlen. Die Berechnungsformel lautet:  Menge von NHS ester (mg)=8 x Masse der zu markierenden Substanz (mg) x molare Masse von NHS ester (Da)/molare Masse der zu markierenden Substanz (Da). Zum Beispiel: Man markiert 3mg Anti-GST (molare Masse 150kDa) mit Cy5.5 NHS ester (molare Masse 716.31Da). Dann benötigt man 8 x 3mg x 716.31Da/150kDa=0.115mg Cy5.5 NHS ester.

(3) Vorbereitung des Anti-GST-Antikörpers: Den Anti-GST-Antikörper(Konzentration: 0.5mL bei 3mg/mL) 4 Stunden bei Raumtemperatur gegen 1L 0.15M NaCl-Lösung dialysieren. Dann über Nacht bei 4°C gegen 1L frische 0.15M NaCl-Lösung noch einmal dialysieren. Am nächsten Tag folgt eine 4-stündige Dialyse gegen 1L 0.1M NaHCO₃-Lösung (pH=8.3). Die Antikörper-Lösung mit einer 0.22μm Spritzenfilter filtern. Eine kleine Probe des Antikörpers mit 0.1M NaHCO₃ verdünnen. Die UV-Absorption bei 280 nm messen. Daraus ermittelt man die Gesamtmenge des zu markierenden Antikörpers(Der molare Extinktionskoeffizient von von IgG-Antikörpern bei 280 nm beträgt 170000M^-1cm^-1 .). 

(4) Markierung: Die Cy5.5-NHS-ester-Lösung langsam in kleinen Portionen zur Antikörper-Lösung geben und dabei sanft rühren. Die Reaktion vor Licht schützen und unter stetigem Rühren inkubieren. Entweder 45 Minuten bei Raumtemperatur oder 4 Stunden bei 4°C.

(5) Protein-Aufreinigung: Im Dunkeln bei Raumtemperatur 4 Stunden gegen 1L 0.15M NaCl-Lösung dialysieren. Dadurch entfernt man unmarkierten Cy5.5 NHS ester. Über Nacht bei 4°C im Dunkeln gegen 1L frische 0.15M NaCl-Lösung noch einmal dialysieren. Dann 4 Stunden bei Raumtemperatur im Dunkeln gegen 1L 0.01M PBS/0.01% Natriumazid-Lösung dialysieren. Nochmals über Nacht bei 4°C im Dunkeln dialysieren. Die Antikörper-Lösung mit einem 0.22μm Spritzenfilter filtern. Die markierte Antikörper-Lösung mit einem ganzzahligen Vielfachen der 0.01M PBS/0.01% Natriumazid-Lösung verdünnen. Die UV-Vis-Absorption bei 280 nm(Protein) und bei 678 nm(Cy5.5) messen.

(6) Berechnung des F/P-Wertes: Der molare Extinktionskoeffizient von Cy5.5 bei 678 nm beträgt 250000M^-1cm^-1. Der molare Extinktionskoeffizient des Proteins bei 280 nm beträgt 170000M^-1cm^-1. Die Absorption von Cy5.5 bei 280 nm entspricht 18% seiner Absorption bei 678 nm. Den  F/P-Wert mit folgenden Formeln berechnen:

[Cy5.5-Farbstoff] = (A₆₇₈)/250000

[Peptid] = [A₂₈₀ - (0.18 x A₆₇₈)]/170000

F/Pfinal = [Farbstoff]/[Peptid] = {0.68 x A₆₇₈}/{A₂₈₀ - (0.18 x A₆₇₈)}

Hinweise: 

(1) Die Stabilität von mit CyDye markierten Proteinen hängt vom jeweiligen Protein ab. Zum Beispiel: Markiertes IgG ist im Dunkeln bei 4°C 2 Monate lang haltbar. Für eine längere Lagerung ein gleiches Volumen an Glycerin zugeben und es im Dunkeln bei -20°C lagern. 

(2) Die Cy5.5-NHS-ester-Lösung bitte unmittelbar vor der Verwendung zubereiten. DMSO-Stammlösungen können kurzfristig im Dunkeln bei -20°C aufbewahrt werden. Für eine gute Aktivität wird eine frische Zubereitung empfohlen. 

(3) Alle Arbeitsschritte müssen streng im Dunkeln ausgeführt werden. Das verhindert die Photobleichung des Fluoreszenzfarbstoffs. 

(4) Zu Ihrem Schutz bitte einen Laborkittel und Einweghandschuhe während der Versuchsdurchführung tragen.