Cell Counting Kit-8 (CCK-8)

Zellzahlbestimmung

1. Zellsuspension(100 μL/Well) in eine 96-Well-Platte inokulieren. Die Platte in einem befeuchteten Inkubator(z.B. bei 37°C, 5% CO₂) vorinkubieren.

2. 10 μL der CCK-Lösung in jede Vertiefung der Platte geben. Achten Sie darauf, dass keine Luftblasen in die Wells gelangen, da diese die OD-Messung verfälschen.

3. Die Platte 1-4 Stunden im Inkubator inkubieren.

4. Die Absorption bei 450 nm mit einem Mikroplattenlesegerät messen.

Zellproliferation und Zytotoxizitätstest

1. Zellen in einer 96-Well-Platte mit einer Dichte von 10³-10⁴ Zellen/Vertiefung in 100 μL des zu testenden Kulturmediums aussäen. Die Zellen 24 Stunden in einem CO₂-Inkubator bei 37°C kultivieren.

2. Geben Sie die zu testenden Substanzen in verschiedenen Konzentrationen auf die Platte.

3. Inkubieren Sie die Platte für eine geeignete Zeit(z.B. 6, 12, 24 oder 48 Stunden) im Inkubator.

4. Geben Sie mit einer Mehrfachpipette 10 μL CCK8-Lösung in jede Vertiefung der Platte. Achten Sie darauf, dass keine Luftblasen in die Vertiefungen gelangen, da diese die OD-Messung beeinträchtigen.

5. Inkubieren Sie die Blatte 1-4 Stunden im Inkubator.

6. Vor dem Auslesen ist es wichtig, die Platte 1 Minute lang vorsichtig auf einem Orbitalschüttler zu mischen, um eine homogene Farbverteilung zu gewährleisten.

7. Messen Sie die Absorption bei 450 nm mit einem Mikroplattenlesegerät.

Datenanalyse

Es gibt verschiedene Möglichkeiten zur statistischen Analyse. Sie können OD-Werte oder Zellzahlen verwenden. Wir bieten eine davon an.

Zellebensfähigkeit(%) = [(As-Ab) / (Ac-Ab)] × 100

Hemmrate(%) = [(Ac-As) / (Ac-Ab)] × 100

As = Absorption der experimentellen Vertiefungen (Absorption von Zellen, Medium, CCK8 und Vertiefungen der Testsubstanz).

Ab = Absorption der Blindprobe(Absorption der Vertiefungen mit Medium und CCK8).

Ac = Absorption der Kontrollvertiefung (Absorption der Vertiefungen mit Zellen, Medium und CCK8).

Erstellen einer Standardkurve

1. Die Zellzählplatte zählt die Anzahl der Zellen in der Zellsuspension.

2. Die Zellsuspension wird mit dem Medium auf einen Konzentrationsgradienten verdünnt. Normalerweise sind dafür 5-7 Konzentrationsgradienten erforderlich, einige Replikationsvertiefungen pro Gruppe. Dann werden die Zellen beimpft. (Beachten Sie die Zahl der Zellen pro Vertiefung. Wenn Sie die Zellsuspension in einem Röhrchen verdünnen, mischen Sie die Zellen noch einmal sorgfältig, bevor Sie die Vertiefungen auf die Platte geben. Das Volumen der Zellsuspension in jeder Vertiefung soll gleich sein.)

3. Inkubieren Sie, bis die Zellen adhärent sind(normalerweise 2-4 Stunden) und geben Sie dann 10 μl CCK8 pro 100 μl Medium hinzu. Die Inkubation wurde 1-4 Stunden fortgesetzt und die Absorption bei 450 nm wurde mit einem Mikroplattenlesegerät gemessen. Erstellen Sie eine Standardkurve mit der Zellzahl als X-Achsen-Koordinate und dem O.D.-Wert als Y-Achsen-Koordinate.

Die Zellzahl der zu testenden Probe kann basierend auf der Kurve bestimmt werden. Voraussetzung für die Verwendung der Standardkurve sind identische Kulturbedingungen.

Vorsichtsmaßnahmen

1. Stellen Sie sicher, dass das Medikament und CCK8 gleichmäßig im Medium verteilt sind.

2. Je stärker die Zellen proliferieren, desto dunkler die Farbe; je stärker die Zytotoxizität, desto heller die Farbe.

3. Für adhärente Zellen sind mindestens 1000 Zellen pro Well (100 μl Medium) erforderlich. Für Leukozyten sind aufgrund ihrer geringen Sensitivität mindestens 2500 Zellen pro Well (100 μl Medium) erforderlich. Die empfohlene 96-Well-Platte hat eine maximale Zellzahl von 25,000 pro Well. Wenn der Test mit einer 24-Well- oder 6-Well-Platte durchgeführt wird, berechnen Sie die entsprechende Zellzahl pro Well und passen Sie das CCK8-Volumen auf 10% des gesamten Flüssigkeitsvolumens pro Well an.

4. Da der CCK8-Test auf der Dehydrogenaseaktivität in lebenden Zellen basiert, können Bedingungen oder Chemikalien, die die Dehydrogenaseaktivität beeinflussen, zu einer Abweichung zwischen der tatsächlichen Zahl lebender Zellen und der mit CCK8 gemessenen Zahl lebender Zellen führen.

5. WST-8 kann mit einem Reduktionsmittel zu WST-8-Formazan reagieren. Die Verwendung eines Reduktionsmittels(z.B. einiger Antioxidantien) beeinträchtigt den Test. Wenn mehr Reduktionsmittel im zu testenden System vorhanden ist, muss das entfernt werden.

6. Nach 2 Stunden Inkubation beträgt der Hintergrund-OD-Wert typischerweise 0.1-0.2 Einheiten.

7. Achten Sie darauf, keine Luftblasen in die Löcher zu bringen, da diese den OD-Wert beeinträchtigen.

8. Wenn Sie die CCK8-Lösung sterilisieren möchten, verwenden Sie eine 0.2 μm Membranfilterlösung.

9. Die Inkubationszeit variiert je nach Art und Menge der Zellen in der Vertiefung. Leukozyten sind im Allgemeinen weniger gefärbt und benötigen möglicherweise längere Inkubationszeiten(bis zu 4 Stunden) oder eine große Zellzahl(~10⁵ Zellen/Well).

10. Bei starker Trübung der Zellsuspension den O.D.-Wert der Probe bei 600 nm oder höher messen und abziehen.

11. CCK8 kann nicht zur Zellfärbung verwendet werden.

12. Das Phenolrot im Medium beeinflusst die Versuchsergebnisse nicht. Die Absorption von Phenolrot kann durch Subtraktion der Absorption des Hintergrunds im Blindloch während der Berechnung eliminiert werden, sodass die Detektion nicht beeinflusst wird.

13. Die Toxizität von CCK8 ist sehr gering. Nach Abschluss des CCK8-Tests können dieselben Zellen für andere Zellproliferationsassays verwendet werden, z.B. für Kristallviolett-Assays, Neutralrot-Assays oder DNA-Fluoreszenz-Assays. (Sofern die Zellen nicht extrem selten sind, wird das nicht empfohlen.)

14. Das Kit kann in E. coli verwendet werden, aber nicht in Hefezellen.

15. Vor dem Ablesen der Platte können Sie die Proben vorsichtig auf dem Schüttler mischen.

16. Wir empfehlen, die Zellen in Vertiefungen nahe der Plattenmitte zu inokulieren. Das Medium im äußersten Lochkreis verdunstet leicht und kann mit PBS, Wasser oder Medium aufgefüllt werden.

17. Falls Sie keinen 450 nm Filter haben, Können Sie auch Filter mit einer Absorption zwischen 430 und 490 nm sowie 450 nm Filter für optimale Empfindlichkeit verwenden.

18. Messen Sie die Absorption bei 450 nm. Für eine Messung mit zwei Wellenlängen kann die Absorption bei 650 nm als Referenzwellenlänge bestimmt werden.

19. Metallionen im Arzneimittel können die Empfindlichkeit von CCK8 beeinträchtigen. Bleichlorid, Eisenchlorid und Kupfersulfat in einer Endkonzentration von 1 mM hemmen die Farbreaktion um 5%, 15% bzw. 90% und verringern so die Empfindlichkeit. Wenn die Endkonzentration 10 mM beträgt, ist eine Hemmung von 100% gegeben.