PPACK (Synonyms: Pebac, D-Phenylalanyl-prolyl-arginyl Chloromethyl Ketone)

Kinetische Verfahren(Inhibition von Thrombin mit PPACK) ^[1]:

Vorbereitungsmethode

Die Thrombin-Stammlösung wurde im entsprechenden Puffer verdünnt. Dadurch entstand eine 20 mL Lösung mit einer Konzentration von 3-5×10^-10 M. Ein Aliquot von 980 μL wurde in einer Küvette im temperaturgeregelten Zellkompartiment des Spektrophotometers inkubiert, um ein thermisches Gleichgewicht zu erreichen. Die Thrombinhemmung wurde durch Injektion von 10 μL einer thermisch äquilibrierten 1.1 × 10^-7 to 3.65 × 10^-7 M PPACK-Lösung und Mischen eingeleitet. Das Reaktionsgemisch wurde sofort für einen Zeitraum zwischen 15 und 200 Sekunden inkubiert. Danach wurden schnell 10 μL einer 3-5×10^-3 M Substratlösung in DMSO hinzugefügt, um die verbleibende Enzymaktivität zu messen. Geschwindigkeitskonstanten Pseudo-erster Ordnung wurden berechnet, dadurch dass die Exponentialfunktion an die verbleibende Enzymaktivität gegenüber die Hemmzeit für 10 aufeinanderfolgende Inkubationszeiten angepasst wurde. Die Thrombinaktivität blieb während der gesamten Dauer des Experiments im Temperaturbereich von 288-308 K konstant.

Anwendungen

PPACK ist ein starker selektiver und irreversibler Thrombininhibitor, der menschliches Alpha-Thrombin mit einem K_i-Wert von 0.24 nM hemmt.

Zelllinien

Rinderaorta-Endothelzellen

Vorbereitungsmethode

Drei bis fünf Tage nach der Plattierung auf Polycarbonat-Membranclusterplatten wurden konfluente Monoschichten der Rinderaorta-Endothelzellen gewonnen. Die Zellen wurden mit Plasminogen und einem Plasminogenaktivator behandelt. PPACK wurde in die oberen Kompartimente gegeben. Die Monoschichten wurden dann zwei Stunden lang in einer 5% CO₂ / 95% O₂ Atmosphäre inkubiert.

Reaktionsbedingungen

Anwendungen

Durch die Koinkubation mit PPACK wurde die durch Plasmin induzierte Erhöhung der Endothelpermeabilität um 59% reduziert.

Zelllinien

Menschliche Osteoarthritis synoviale Fibroblasten(OASF)

Vorbereitungsmethode

Die Zellen wurden 24 Stunden lang mit Thrombin(3 U/ml), Thrombin plus PPACK (30 nM) behandelt.

Reaktionsbedingungen

Anwendungen

Durch die Vorbehandlung der Zellen mit PPACK konnte die verstärkende Wirkung von Thrombin auf die HO-1-Expression wirksam antagonisiert werden.

Tiermodelle

Männliche Kaninchen

Vorbereitungsmethode

PPACK wurde in Kochsalzlösung zubereitet und als Bolusdosis von 10-100 μg/kg oder als Infusion von 0.25-1.0 μg/kg/min verabreicht. Kaninchen wurden 1 Minute vor oder nach der Verabreichung von Thrombin mit einem PPACK-Bolus behandelt oder erhielten 30 Minuten vor der Verabreichung von Thrombin eine Infusion mit PPACK, die eine Stunde lang mit einer Rate von 0.1 mL/min fortgesetzt wurde.

Anwendungen

Eine Vorbehandlung mit PPACK kann eine durch Thrombin verursachte zerebrale Thromboembolie bei Kaninchen hemmen.

References:

[1]. Kovach IM, Kelley P, et,al. Proton bridging in the interactions of thrombin with small inhibitors. Biochemistry. 2009 Aug 4;48(30):7296-304. doi: 10.1021/bi900098s. PMID: 19530705; PMCID: PMC2800789.

[2]. Rabbani LE, Johnstone MT, et,al. PPACK attenuates plasmin-induced changes in endothelial integrity. Thromb Res. 1993 Jun 15;70(6):425-36. doi: 10.1016/0049-3848(93)90085-3. PMID: 8362368.

[3].Liu JF, Hou SM, et,al. Thrombin induces heme oxygenase-1 expression in human synovial fibroblasts through protease-activated receptor signaling pathways. Arthritis Res Ther. 2012 Apr 27;14(2):R91. doi: 10.1186/ar3815. PMID: 22541814; PMCID: PMC3446465.

[4]. Liu JT, Paul W, et,al. Thrombin inhibitors and anti-coagulants on thrombin-induced embolisation in rabbit cranial vasculature. Eur J Pharmacol. 1994 Oct 24;264(2):183-90. doi: 10.1016/0014-2999(94)00464-1. PMID: 7851481.