Hoechst 33342

Ce plan ne fournit qu'un guide général. Veuillez le modifier selon vos besoins spécifiques.

1. Préparation de la solution de coloration Hoechst 33342

1.1 Préparation de la solution mère de Hoechst 33342 : Dissoudre le Hoechst 33342 solide dans du DMSO pour préparer une solution mère de colorant à 10 mg/mL.

Remarque : Il est recommandé de diviser la solution mère de Hoechst en aliquotes et de la conserver à l'obscurité à -4°C ou -20°C pour éviter des cycles répétés de congélation et décongélation.

1.2 Préparation de la solution de travail : Diluer la solution mère avec un milieu sans sérum préchauffé ou un tampon (tel que HBSS ou PBS) pour préparer une solution de travail de Hoechst 33342 à une concentration de 10 μg/mL.

Remarque : Ajuster la concentration de la solution de travail en fonction des besoins expérimentaux et la préparer juste avant l'utilisation.

2. Coloration cellulaire

2.1 Cellules en suspension (exemple : plaque de 6 puits)

1. Centrifuger les cellules en suspension à 1000g pendant 3 à 5 minutes. Retirer le surnageant et laver deux fois avec du PBS pendant 5 minutes à chaque lavage.

2. Ajouter 1 mL de solution de travail de Hoechst 33342 et incuber à température ambiante, à l’obscurité, pendant 5 à 10 minutes.

3. Après l’incubation, centrifuger à 1000g pendant 5 minutes, éliminer le surnageant, ajouter du PBS et laver 2 à 3 fois pendant 5 minutes à chaque fois.

4. Resuspendre les cellules avec un milieu de culture cellulaire sans sérum ou du PBS et les observer par microscopie à fluorescence ou cytométrie en flux.

2.2 Cellules adhérentes

1. Cultiver les cellules adhérentes sur des lamelles stériles.

2. Retirer la lamelle du milieu de culture, aspirer le surplus de milieu et placer la lamelle dans un environnement humide.

3. Ajouter 100 µL de solution de travail de Hoechst 33342 à un coin de la lamelle, agiter délicatement pour couvrir uniformément toutes les cellules avec le colorant, puis incuber à température ambiante, à l’obscurité, pendant 5 à 15 minutes.

4. Aspirer la solution de coloration, laver la lamelle 2 à 3 fois avec du milieu de culture, puis observer au microscope à fluorescence.

3. Détection par microscopie

La lumière d'excitation/émission de Hoechst 33342 est respectivement de 350/461 nm.

Précautions :

1. Pour la coloration des cellules fixées ou des échantillons tissulaires, le fixateur doit être éliminé par rinçage après fixation.

2. La coloration Hoechst 33342 est généralement effectuée après d'autres colorations. Si aucune autre coloration n'est nécessaire, la coloration Hoechst 33342 peut être réalisée directement.

3. Pour ralentir l'extinction de la fluorescence, il est recommandé d'utiliser un agent de montage anti-extinction.

4. Les colorants fluorescents présentent tous des problèmes d'extinction ; essayez donc d'éviter la lumière.

5. Le Hoechst 33342 est irritant pour le corps humain. Pour votre sécurité et votre santé, portez une blouse de laboratoire et des gants jetables lors de la manipulation.

Références :

[1]. Lisa C Crowley, Brooke J Marfell, Nigel J Waterhouse. Analyzing Cell Death by Nuclear Staining with Hoechst 33342. 2016 Sep 1;2016(9). doi: 10.1101/pdb.prot087205.