Sel-green

Application de la sonde Sel-green pour l'imagerie fluorescente du sélénol dans des cellules vivantes^[1]

Ce protocole est adapté de données de recherche et fourni à titre de référence uniquement. Des ajustements peuvent être nécessaires selon les exigences expérimentales spécifiques.

1. Préparation des réactifs: Dissoudre Sel-green dans du diméthylsulfoxide (DMSO) pour préparer une solution mère à une concentration appropriée (ex., 5-10mM). Diluer avec un milieu de culture cellulaire jusqu'à une concentration de travail de 20µM avant utilisation. Préparer des solutions de traitement contenant des composés séléniés (ex., Na₂SeO₃, (Sec)₂, etc.) en utilisant un milieu de culture cellulaire. La concentration de travail est typiquement de 5µM. Le milieu complet contient 10% de sérum foetal bovin (FBS), 2mM de glutamine, 100U/mL de pénicilline/streptomycine.

2. Culture et ensemencement des cellules: Réaliser une culture routine de cellules(ex., HepG2, HeLa) dans le milieu complet ci-dessus à 37°C avec 5% de CO₂. Un jour avant l'expérience d'imagerie, ensemencer les cellules à une densité appropriée dans des plaques de 12 ou 24 puits, en ajoutant le volume de milieu adéquat (ex., 1mL pour les plaques de 12 puits, 0.5mL pour les plaques de 24 puits). Laisser les cellules adhérer pendant 24 heures.

3. Traitement des cellules et incubation de la sonde:

(1) Induction des sélénols endogènes: Pour détecter la sélénocystéine (Sec) endogène, prétraiter les cellules avec Na₂SeO₃ (5µM) pendant 1 heure ou 12 heures avant l'imagerie afin d'augmenter les niveaux intracellulaires de Sec.

(2) Détection des sélénols exogènes: Pour détecter la Sec exogène, traiter les cellules avec (Sec)₂ (5µM) pendant 1 heure.

(3) Etude du métabolisme de différents composés séléniés: Traiter les cellules avec les composés séléniés ciblés (ex., SeO₂, Na₂SeO₃, DBDS, etc.; 5µM) pendant 1, 6 ou 12 heures. Après le traitement, laver les cellules trois fois avec PBS préchauffé pour éliminer les composés résiduels du milieu.

4. Imagerie par fluorescence: Ajouter la solution de travail de Sel-green fraîchement préparée (20µM dans du milieu) aux cellules lavées. Incuber à 37°C à l'obscurité pendant 30 minutes. After l'incubation, laver les cellules trois fois avec PBS pour éliminer la sonde non incroporée. Observer et capturer immédiatement les images à l'aide d'un système d'imagerie par fluorescence. Sel-green prouduit une fluorescence verte avec des longueurs d'onde d' excitation/d'émission d'environ 370/502nm.

Précautions:

(1) Sel-green est la première sonde sélective pour le sélénol fonctionnant dans des conditions physiolotiques (pH=7.4). Son signal de réponse à la Sec est plus de 100 fois supérieur à celui obtenu avec des thiols biologiques courants (ex., Cys, GSH).

(2) Un inconvénient potentiel de Sel-green est sa sensibilité relativement faible en imagerie cellulaire, ce qui peut limiter son application pour la détection de faibles concentrations de sélénols endogènes in vivo.

(3) Pour votre sécurité et votre santé, veuillez porter une blouse de laboratoire et des gants jetables pendant les manipulations.

References:
[1] Zhang B, Ge C, Yao J, et al. Selective selenol fluorescent probes: design, synthesis, structural determinants, and biological applications. J Am Chem Soc. 2015 Jan 21;137(2):757-69.