Détection de l'apoptose par Zinquin[1]
Ce protocol est adapté de données d'étude et fourni à titre de référence uniquement. Des ajustements peuvent être nécessaires selon les exigences expérimentales spécifiques.
1. Préparation des réactifs: Zinquin est dissoute dans du diméthylsulfoxide (DMSO) à une concentration de 5mM et conservée à -20°C. Avant utilisation, Zinquin est diluée à la concentration de travail (ex., 25μM) avec une solution saline équilibrée de Hanks (HBSS, pH=7.4, contenant de 1.3mM de Ca²⁺ , 0.9mM de Mg²⁺, 4.2mM de NaHCO₃). Les autres réactifs comprennent du ZnSO₄·7H₂O, du pyrithione de sodium (un ionophore du zinc ) et du TPEN (un chélateur du zinc).
2. Préparation des cellules: Les cellules (5×10⁶ cellules/mL) sont incubées à 37°C avec 25μM de ZnSO₄ et une concentration spécifiée (généralement 1à 4μM) de pyrithione de sodium durant 40min, puis lavées trois fois avec HBSS pour éliminer le zinc extracellulaire. Autre possibilité: les cellules sont incubées avec différentes concentrations (0–100μM) de TPEN dans le milieu de culture durant des périodes allant de quelques dizaines de minutes à plusieurs heures pour réduire les taux de zinc labile intracellulaire.
3. Marquage par Zinquin et détection de fluorescence : Les cellules traitées sont incubées avec Zinquin (25μM) dans HBSS à 37°C durant 30min. Après l'incubation, les cellules sont collectées, et l'intensité de fluorescence de Zinquin est mesurée à l'aide d'un lecteur de microplaques (longueur d'onde d'excitation/émission = 368/490nm).
Précautions:
(1) Zinquin est spécifique du Zn²⁺ (le Cd²⁺ peut aussi augmenter la fluorescence, mais sa teneur dans les tissus biologiques est très faible; le Ca²⁺ et le Mg²⁺ n'ong presque aucun effet; le Cu²⁺ et le Fe²⁺ étaignent la fluorescence). Zinquin forme principalement des complexes 1:1 et 1:2 avec le Zn²⁺, avec des constantes de liaison relativement faibles (environ 10⁶L/mol), et peut ne pa détecter le zinc lié de manière forte aux sites actifs des métalloenzymes.
(2) La forme acide libre de Zinquin traverse passivement les membranes sans nécessité d'hydrolyse par estérase. A des concentrations élevées, Zinquin peut transporter le zinc selon un mode d'échange 1 Zn²⁺ contre 2 H⁺ , un processus inhibé par les gradients de pH transmembranaires.
(3) Le signal de fluorescence reste stable durant 1–2 heures; un lavage après le marquage n'affecte pas l'intensité de fluorescence, ce qui indique que la sonde est retenue efficacement à l'intérieur des cellules.
(4) Pour votre sécurité et votre santé, veuillez porter une blouse de laboratoire et des gants jetables durant la manipulation.
References:
[1] Zalewski PD, Forbes IJ, Betts WH. Correlation of apoptosis with change in intracellular labile Zn(II) using zinquin [(2-methyl-8-p-toluenesulphonamido-6-quinolyloxy)acetic acid], a new specific fluorescent probe for Zn(II). Biochem J. 1993 Dec 1;296 ( Pt 2)(Pt 2):403-8. |
