ARCA

ARCAを使った正確な方向のキャップ構造を持つmRNAの調製法^[1]

このプロトコールは参考までです。実際のニーズに合わせてご調整願います。

（1）試薬の調製：ARCAを水または適切な緩衝液に溶解し、0.5mMの原液を調製する。0.5mM ATP、0.5mM CTP、0.5mM UTPと0.1mM GTP（ARCAとGTPのモル比は5:1）を含有するNTP混合物を調製する。SP6またはT7 RNAポリメラーゼ、DNAテンプレート、RNase阻害剤と転写緩衝液を調製する。

（2）In vitro転写反応系の構築：600ng DNAテンプレート、1U/μL RNase阻害剤、0.5mM ATP/CTP/UTP、0.1mM GTPと0.5mM ARCAを転写緩衝液に添加する。SP6またはT7 RNAポリメラーゼを添加する。

（3）mRNAの合成：37℃で1時間インキュベートする。2μL DNaseを添加し、37℃で20分間インキュベートし、テンプレートDNAを除去する。RNA生成物を精製し、正確な方向を持つARCAキャップ構造を持つmRNAを得る。

（4）ARCAキャップ付きmRNAの翻訳検証：ARCAキャップ付きmRNAをHEK293細胞（DMEM+10%FBS；37°C；5%CO2）にトランスフェクトし、またはウサギ網状赤血球ライセートを添加し、30℃で60分間インキュベートする。翻訳効率をルシフェラーゼ発光値で評価する。RT-qPCRを使い、残りのmRNAの割合をHEK293細胞で検出し、安定性を評価する。

注意事項：

（1）RNAの分解を阻止する為に、実験中に無RNaseの消耗品を使い、氷の上で操作を行う。

（2）ご自分の安全と健康の為に、操作時は白衣と使い捨ての手袋をご装着願います。